《mSphere》：Increased triacylglyceride and ceramide levels are key for MERS-CoV replication
编辑推荐：
本综述通过多组学整合分析，揭示了MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）劫持宿主脂质代谢的核心机制。研究证实病毒通过鞘磷脂酶（SMase）途径上调神经酰胺（Ceramide），并依赖酰基辅酶A合成酶3（ACSL3）促进甘油三酯（TAG）合成及脂滴（LD）形成，从而驱动病毒复制。靶向抑制ACSL3或酸性鞘磷脂酶（ASMase）活性可有效抑制病毒复制，为开发靶向脂质代谢的抗冠状病毒疗法提供了新策略。
MERS-CoV感染诱导脂质相关转录本和蛋白的差异表达
为了解人类冠状病毒感染如何改变脂质相关的转录本和蛋白，研究团队调查了MERS-CoV在三种不同原代人肺细胞类型中的感染情况。功能富集分析结果显示，MERS-CoV感染导致与细胞内膜和细胞器相关的基因集表达广泛下调，尤其是在感染的成纤维细胞（FB）和微血管内皮细胞（MVE）中。值得注意的是，内质网（ER）相关术语的下调尤为突出，因为ER是脂质合成的主要场所。然而，与普遍下调的趋势相反，介导细胞转录、染色质结构维持以及tRNA加工和甲基化的mRNA物种表达在感染期间增加，表明冠状病毒感染并非全面抑制转录。特别有趣的是，介导细胞翻译的转录本在MERS-CoV感染后表达降低，这可能暗示细胞通过保守资源来限制感染造成的损伤。
MERS-CoV感染降低与溶酶体相关、脂质相关转录因子应答相关的基因和蛋白的表达
深入研究脂质相关基因的作用发现，被归类为溶酶体相关或对固醇调节元件结合蛋白（SREBP）或转录因子EB（TFEB）有应答的基因，其主要趋势是表达降低。这些溶酶体相关基因的趋势支持了先前的一项转录组学研究，该研究表明MERS-CoV NSP1蛋白的内切核糖核酸酶功能有助于降低溶酶体相关转录本。与原代细胞数据一致，对感染小鼠适应性MERS-CoV的全鼠肺转录组数据的分析也显示，脂质相关小鼠基因的变化绝大多数是下调的。鉴于病毒复制复合物和MERS-CoV子代病毒粒子的组装需要大量特定的脂质物种，研究团队假设脂质相关细胞机制中的某个较小组成部分在感染期间必须被上调。通过简单的计数程序，研究人员从脂质相关蛋白中识别出最强的上调信号。
ACSL3介导的长链脂肪酸酯化对MERS-CoV复制至关重要
在 predominantly 下调的蛋白表达背景下，分析确定酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL3）和 sequestosome 1（SQSTM1）是MERS-CoV感染的原代人肺细胞中最显著上调的具有脂质相关功能的蛋白。ACSL3介导脂肪酸氧化，导致甘油三酯（TG）合成，并定位于脂滴（LD）和内质网且在其中发挥功能。为了确定通过ACSL3抑制脂肪酸代谢是否会改变MERS-CoV复制水平，研究人员在原代和永生化人肺细胞中进行了抑制剂研究。Triacsin C是ACSL3等长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶的有效抑制剂，它介导脂肪酸向酰基辅酶的转化，这是de novoTG合成的早期步骤。研究发现在亚细胞毒性水平下，Triacsin C处理以剂量依赖性方式降低了人肺细胞中纳米荧光素酶的表达水平，表明阻断ACSL3活性确实降低了MERS-LUC感染后所有三种细胞类型中的MERS-CoV复制。相比之下，抑制肉碱棕榈酰转移酶-1（位于脂肪酸β-氧化途径中ACSL3下游的线粒体相关酶）的Etomoxir处理，也降低了MERS-LUC感染后的纳米荧光素酶表达，这表明脂肪酸β-氧化对于MERS-CoV复制可能比对于SARS-CoV-2更重要。
MERS-CoV感染以细胞类型依赖性模式显著改变三种主要脂质亚类的表达
对脂质组学数据集的深入分析揭示，鞘磷脂（SM）物种的丰度显著降低。这些数据支持SM可能是MERS-CoV复制期间检测到的神经酰胺增加的前体，这将需要活跃的酸性鞘磷脂酶（ASMase）活性。为了研究de novo神经酰胺生产在MERS-CoV复制中的作用，研究人员进行了抑制剂研究。使用Myriocin或Fumonisin B1处理MERS-CoV-LUC感染的细胞，对细胞活力或纳米荧光素酶表达水平没有产生影响，表明de novo合成并非MERS-CoV复制过程中神经酰胺生产的关键途径。接下来，研究人员调查了神经酰胺生产的增加和随之而来的SM物种减少是否源于鞘磷脂酶（SMase）活性。功能抑制剂 of acid sphingomyelinase（FIASMA）是一大类抑制酸性鞘磷脂酶（ASMase）活性的药物化合物。使用FIASMA抑制剂去西帕明（desipramine）处理可降低纳米荧光素酶表达水平，且在没有细胞毒性的剂量下，表明ASMase活性对MERS-CoV复制很重要。然而，并非所有测试的FIASMA药物都能减少纳米荧光素酶表达，这与这些药物在其他测试条件下的不同功效一致。
探讨mTORC1在不同细胞类型中的潜在参与作用
对具有脂质合成相关功能的基因/蛋白集的转录组学和蛋白质组学分析显示，MERS-CoV感染后其表达降低。mTORC1蛋白复合物是许多细胞过程的主要调节点，包括转录本、蛋白质和脂质合成，以及生长、运动、存活和自噬。病毒-宿主相互作用很复杂，可能由mTORC1复合物介导，因为该复合物是病毒感染等代谢过程重大干扰的控制点。mTORC1功能调节的细胞通路与本分析中几个感兴趣的蛋白有关，包括TFEB、SQSTM1和SREBP。一种可能的情况是，MERS-CoV感染有利于维持mTORC1信号传导，以维持足够的蛋白质和脂质合成供病毒复制。因此，抑制mTORC1预计会对MERS-CoV复制产生负面影响。在永生化人肺上皮细胞中，需要30μM的雷帕霉素（rapamycin）才能降低MERS-LUC纳米荧光素酶的表达水平。这些结果表明，宿主细胞可能试图下调代谢资源；成功的MERS-CoV复制可能需要保留部分mTORC1信号传导，尽管对mTORC1的需求似乎因细胞类型而异。
讨论
通过整合功能富集与靶向药理学感染表型扰动相结合的方法，本研究识别并成功测试了可能代表MERS-CoV感染关键治疗靶点的候选脂质调节通路。关注具有脂质相关功能的转录本、脂质和蛋白质，扩展了先前的分析，并确定了冠状病毒复制所必需的额外细胞通路。MERS-CoV感染导致与溶酶体、SREBP和TFEB细胞GO通路功能相关的转录本表达降低。对脂质组学数据集的进一步深入分析表明，鞘磷脂（SM）物种的丰度显著降低，支持SM可能是通过需要活性酸性鞘磷脂酶（ASMase）的途径增加神经酰胺的前体。抑制剂研究证实ASMase活性对MERS-CoV复制很重要。在 predominantly 下调的蛋白表达背景下，ACSL3和SQSTM1被确定为MERS-CoV感染的原代人肺细胞中最显著上调的具有脂质相关功能的蛋白。结合多种细胞类型中甘油三酯（TG）物种的显著增加，表明ACSL3活性可能对成功的MERS-CoV复制至关重要。Triacsin C处理显著影响MERS-CoV感染，支持了这一假设。SQSTM1/p62是一种泛素结合蛋白，其细胞丰度与自噬的激活呈负相关。在不同MERS-CoV感染的原代人肺细胞类型中观察到的独特SQSTM1反应表明，冠状病毒感染期间的自噬是高度依赖于背景的。尽管使用mTORC1抑制剂的初步结果表明其活性可能是MERS-CoV感染所必需的，但mTORC1在脂质代谢调节中的复杂作用使得难以确定其作用是否与脂质相关。
材料与方法
研究使用了从人传导气道分离的原代人肺细胞，并在之前描述的方案下进行处理。使用表达纳米荧光素酶的重组MERS-CoV（MERS-LUC）和SARS-CoV-2（SARS2-LUC）进行病毒滴定和抑制剂研究。对先前发表的转录组学、蛋白质组学和脂质组学样本进行功能富集分析。使用特定的基因集进行分析，包括TFEB应答基因、溶酶体基因和SREBP基因。抑制剂研究涉及用一系列稀释度的各种抑制剂处理病毒感染细胞，并使用细胞活力测定和纳米荧光素酶检测来评估细胞毒性和病毒复制。
结论
本研究强调了在转录本、蛋白质和其他组学平台旁边查询脂质物种扰动的重要性。数据支持酸性鞘磷脂酶（ASMase）活性的重要性，并证明ACSL3介导的脂肪酸合成的激活是有效MERS-CoV感染所必需的，可能是通过甘油三酯（TG）生产和脂滴（LD）形成。因此，鞘磷脂（SM）、神经酰胺和甘油三酯（TG）的合成和细胞内储存途径代表了MERS-CoV复制的关键控制点，应在未来研究中探索。分析提出了一个模型，其中冠状病毒扰动整体细胞代谢，将资源转向神经酰胺和甘油三酯的生产，并支持通过抑制特定脂质代谢子集来靶向冠状病毒复制的策略。
