《Plant Communications》：Rhizobial effector NopM mediates the ubiquitination of the Nod factor receptor NFR5 and promotes rhizobial symbiosis in Lotus japonicus
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本研究针对根瘤菌III型效应蛋白（T3Es）如何调控豆科植物共生机制不清的问题，通过分子互作、泛素化修饰及遗传学实验，发现Sinorhizobium fredii NGR234的效应蛋白NopM与结瘤因子受体NFR1/NFR5互作，并特异性介导NFR5的多聚单泛素化，从而提升其蛋白稳定性，促进百脉根（Lotus japonicus）的根瘤菌侵染和结瘤。该研究首次揭示根瘤菌效应蛋白直接靶向宿主共生信号通路核心受体，为解析微生物-植物互作进化提供了新视角。
在自然界中，豆科植物与根瘤菌的共生关系是高效固氮系统的典范，能够显著减少作物对化学氮肥的依赖。这一过程始于根瘤菌分泌的结瘤因子（Nod factors, NFs）被植物细胞膜上的受体NFR1和NFR5识别，从而激活共生信号通路。然而，除了NF信号通路，根瘤菌通过III型分泌系统（T3SS）递送的效应蛋白（如Nodulation outer proteins, Nops）也在调控宿主侵染和结瘤中发挥关键作用，但其作用靶点与分子机制尚不明确。尤其令人困惑的是，不同效应蛋白的功能存在拮抗或协同效应，例如效应蛋白NopT可切割NFR5抑制共生，而其他效应蛋白的功能往往被其掩盖。因此，揭示效应蛋白如何精确调控宿主共生信号通路成为当前研究的难点。
为解决上述问题，华中农业大学曹扬荣团队在《Plant Communications》上发表研究，发现效应蛋白NopM能够直接结合NFR1和NFR5，并选择性介导NFR5的泛素化修饰，进而提升其蛋白丰度，促进百脉根的根瘤形成。该研究不仅首次将根瘤菌效应蛋白的作用靶点定位至共生信号通路的受体层面，还揭示了效应蛋白功能的高度上下文依赖性。
本研究主要采用以下关键技术：双分子荧光互补（BiFC）和分裂荧光素酶（LCI）验证蛋白互作；原核重组系统进行体外泛素化与磷酸化分析；百脉根毛根转化与稳定转基因体系进行功能验证；质谱分析鉴定NFR5泛素化位点；系统发育分析比较不同根瘤菌NopM同源蛋白的功能保守性。实验所用百脉根材料包括Gifu生态型、nfr5突变体及pNIN:GUS报告株系，根瘤菌菌株涉及Sinorhizobium fredii NGR234及其突变体、Mesorhizobium loti MAFF303099等。
NopM促进根瘤菌侵染和结瘤形成
在ΔnopT突变背景中，进一步敲除nopM（ΔnopTΩnopM）会导致百脉根感染事件和结瘤数量显著减少，而单敲除nopM未表现表型，说明NopM的促共生作用在NopT缺失时凸显。利用NIN启动子在百脉根中特异性表达NopM，发现转基因植株的根瘤菌侵染点和结瘤数均增加，证实NopM正向调控共生过程。
NopM与NFR1和NFR5相互作用
通过分裂荧光素酶、BiFC和免疫共沉淀实验，发现NopM与NFR1、NFR5的胞内域直接结合。体外Pull-down实验进一步验证了该互作的特异性，表明NopM可能通过结合受体复合物调控下游信号。
NopM介导NFR5的特异性泛素化
在原核泛素化重组系统中，NopM可催化NFR5发生泛素化修饰，而对NFR1无此作用。值得注意的是，激酶失活突变体NFR1K351E可被NopM泛素化，提示NFR1的激酶活性可能抑制自身泛素化。系统发育分析表明，来自不同根瘤菌的NopM同源蛋白均能介导百脉根和大豆来源的NFR5泛素化，说明该机制在共生系统中具有保守性。
NopM表达提升NFR5蛋白水平
在百脉根毛根中表达NopM可提高NFR5-HA的蛋白丰度，而泛素化缺陷突变体NopMC338A无此效应。利用泛素K0变体（UbK0）及质谱分析，发现NopM主要介导NFR5的多聚单泛素化。进一步构建NFR5的11个赖氨酸突变体（NFR511KR），发现其泛素化水平显著降低，且无法回补nfr5突变体的共生缺陷，证明这些位点为NFR5功能所必需。
讨论与结论
本研究提出NopM通过泛素化修饰调控NFR5稳定性，从而精细调控共生信号的新模型。效应蛋白NopM与NopT均靶向NFR5，但作用相反（NopT切割受体，NopM增强其稳定性），体现了根瘤菌效应蛋白在共生中的功能层级网络。研究还指出，NopM的表型效应高度依赖表达 context：组成型高表达可能激发防御反应抑制结瘤，而共生组织特异性表达则促进共生，这解释了本研究与过往报道的表型差异。该工作不仅深化了对根瘤菌效应蛋白功能多样性的理解，也为农业中优化共生固氮效率提供了潜在靶点。
