《mSystems》：Nutrient acquisition drives Edwardsiella tarda pathogenesis in necrotizing soft tissue infection
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本研究通过全基因组转座子插入测序（TraDIS）技术，揭示了坏死性软组织感染（NSTI）病原体迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）在宿主体内存活的关键代谢适应机制。研究首次构建了E. tarda在软组织感染中的全基因组适应性图谱，发现其致病性不仅依赖于经典毒力因子，更由其获取必需营养素（如铁、锌、维生素B6、多胺）和代谢适应宿主营养压力的能力驱动。这项工作挑战了细菌毒力的传统范式，为针对营养获取系统的治疗干预提供了新靶点。
ABSTRACT
坏死性软组织感染（NSTIs）是由多种细菌病原体引起的快速进展、危及生命的疾病。虽然经典的毒力因子，如毒素和分泌系统，已被广泛表征，但代谢适应性在支持细菌在营养受限的宿主环境中存活的作用仍未得到充分探索。迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种与NSTIs相关的人类致病菌，是研究非经典致病策略的新兴模型。本研究采用转座子定向插入位点测序（TraDIS）技术，在小鼠软组织感染模型中鉴定出对E. tarda存活至关重要的基因。全基因组筛选揭示了41个在感染期间显著耗竭的基因，包括那些参与铁和锌获取（fetB, zupT）、维生素生物合成（pdxK, cobA）以及多胺代谢（speB）的基因。使用确定的最小培养基进行的功能测定表明，补充维生素B6或腐胺可增强细菌生长，验证了它们在营养限制条件下对适应性的贡献。我们的研究结果表明，E. tarda的发病机制不仅由经典毒力因子驱动，还由其获取必需营养素和代谢适应宿主施加的营养应激的能力驱动。这项研究首次提供了E. tarda在软组织感染期间的全基因组适应性图谱，并揭示了破坏营养获取系统的治疗干预新靶点。这些结果也强调了代谢适应作为侵袭性细菌感染中毒力决定因素的更广泛相关性。
INTRODUCTION
坏死性软组织感染（NSTIs）是快速进展、危及生命的细菌感染，以广泛的组织坏死和全身毒性为特征。虽然经典的毒力因子，如毒素和分泌系统，已在NSTI病原体（如A组链球菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌和嗜水气单胞菌）中得到广泛研究，但最近的证据表明，代谢适应性和营养获取系统对于细菌在宿主组织内存活和增殖同样至关重要。宿主环境施加多种营养和氧化应激，限制细菌生长。特别是，作为营养免疫的一部分，宿主严格限制对必需营养素如铁、锌、多胺和B族维生素的获取。在伤口相关的NSTIs中经常观察到的多微生物感染中，这种情况进一步复杂化，种间营养竞争不可避免。为了克服这些限制，细菌必须部署专门的转运蛋白、生物合成途径和调控系统，使其生理适应宿主环境。然而，支持细菌在软组织中持续存在的精确遗传决定因素尚不清楚。
虽然迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）历史上被归类为鱼类病原体，但它越来越多地被认为是一种引起人类严重感染的新发人畜共患病原体。最近的分类学修订将鱼类致病菌株重新分类为新属E. piscicida, E. anguillarum和E. ictaluri，而能够感染人类的菌株保留名称E. tarda。临床表现包括胃肠炎、菌血症、肝胆感染和危及生命的软组织感染，如坏死性筋膜炎和肌坏死。来自日本的回顾性研究在12年内确定了26例E. tarda菌血症病例，死亡率高，尤其在患有肝病或免疫抑制的患者中。感染常与接触水生环境或食用生海鲜有关。尽管这些病例具有临床意义，但使E. tarda能够在软组织内存活和增殖的遗传和代谢决定因素仍不清楚。
在本研究中，我们应用转座子定向插入位点测序（TraDIS）全面鉴定E. tarda在软组织环境中存活所需的基因。通过比较体外培养物和从小鼠肌肉组织回收的细菌之间的突变频率，我们系统地筛选了对体内适应性至关重要的基因。功能分类显示，衰减的突变体富集了参与氨基酸和多胺代谢、维生素生物合成、金属离子转运和转录调控的基因。此外，通过使用M9最小培养基进行营养消耗测定，评估了选定的候选基因，验证了它们在确定的营养限制条件下对生长的贡献。总的来说，我们的研究结果揭示了在营养受限的软组织环境中细菌定植和增殖所必需的非经典适应性因子。
RESULTS
Establishment of a murine NSTI model using E. tarda
E. tarda被认为是NSTIs的病原体。然而，能真实再现NSTI临床特征的鼠模型仍然稀缺。为了建立可靠的体内模型，我们评估了细菌预培养条件对致病性的影响。为了比较不同营养条件下的细菌生长和运动性，我们使用了胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（一种含有肽、氨基酸和葡萄糖的营养丰富培养基）和乳糖肉汤（LaB）（一种营养更有限的培养基，其中乳糖是主要碳源）。E. tarda通常在TSB中培养，在37°C下在TSB中生长最旺盛。然而，显微镜观察显示，在25°C的LB中培养的E. tarda表现出最高的运动性。小鼠皮下接种高达107CFU/100 μL的在TSB或LaB中培养的E. tarda。在37°C的TSB中生长的细菌不引起致死性。在25°C的TSB中培养的菌株引起部分死亡率，有几只小鼠存活。相比之下，在37°C的乳糖肉汤（LaB）中制备的培养物在24小时内导致>50%的死亡率。值得注意的是，在25°C的LaB培养物导致所有小鼠快速完全死亡，表明在这些条件下具有高毒力表型。感染组织的组织学分析证实了广泛的肌肉坏死，验证了NSTI样病症的发展。基于这些发现，我们选择在25°C的LaB中培养的E. tarda作为体内模拟NSTI病理的最佳感染前条件。
由于后续TraDIS的目的是鉴定细菌体内生长所需的基因，我们旨在建立一种能区分衰减和适应的转座子突变体的感染条件，即致死但允许细菌在宿主组织中充分增殖的条件。在接种106CFU在25°C的LaB中培养的E. tarda时，感染肌肉组织中的细菌负荷在感染后第3天达到峰值，然后下降，表明第3天代表体内细菌扩张的高峰。该条件诱导一致的致死性，同时提供足够的动态范围来评估突变体存活。因此，选择感染后第3天作为TraDIS分析的最佳时间点回收软组织。
Genome-wide identification of fitness genes required for survival in soft tissue
为了鉴定对软组织发病机制至关重要的细菌基因，构建了一个转座子突变体文库。通过实施Southern印迹证实了转座子在整个基因组中随机插入的发生。为了鉴定E. tarda在软组织中增殖所需的基因，进行了TraDIS。为了规避潜在的瓶颈，将大约25,000个突变体克隆仔细分为三个不同的组并注射到小鼠体内。感染后三天，处于体内活跃生长期，从肌肉组织回收细菌。然后通过比较输入和输出文库之间的突变频率进行负选择分析。对输入库的TraDIS分析显示，在3,473个预测的开放阅读框（ORF）中，有3,348个存在插入，表明广泛的基因组覆盖。将log2倍数变化小于-1且log10P值大于1.3的基因视为体内显著耗竭。在突变体文库包含的3,348个ORF中，仅有41个基因（占1.22%）满足log2倍数变化 ≤ -1且P值 < 0.05的严格标准，因此被认为是对体内适应性至关重要的一组高度选择性基因。这些基因包括参与外膜生物合成的基因，特别是对细胞包膜稳定性和抵抗宿主抗菌因子至关重要的LPS相关蛋白；营养获取系统，如铁和锌转运蛋白；维生素相关代谢，包括吡哆醛激酶和钴(I)胺腺苷转移酶；以及应激反应或转录调控因子，它们可能在感染期间协调代谢适应。这些发现表明E. tarda只需要有限的一组基因来适应软组织环境并在其中增殖。
Role of vitamin and polyamine metabolism in bacterial adaptation
TraDIS还鉴定出几个代谢基因对体内存活至关重要。鉴定出的基因包括：吡哆醛激酶pdxK（维生素B6生物合成）、Cob(I)胺腺苷转移酶（维生素B12活化）和胍基丁胺酶speB（腐胺合成）。此外，还鉴定出与甲硫氨酸和硫代谢相关的基因，包括4-羟基苏氨酸-4-磷酸脱氢酶、硫代硫酸硫转移酶GlpE和厌氧亚硫酸还原酶亚基A。为了确定这些营养素在促进生长中的作用，将它们单独添加到TSB和M9培养基中。在TSB中未观察到生长显著增强。然而，在M9培养基中，生长测定表明，补充腐胺与对照相比显著增加了CFU，而维生素B6、维生素B12和甲硫氨酸则没有，表明E. tarda可以利用这些化合物在营养受限的环境中生长。这些发现证明E. tarda不仅依赖经典毒力系统，还依赖特定的营养获取和代谢途径在宿主体内存活和增殖。
Iron and zinc acquisition systems are critical for in vivo fitness
一些基因与金属离子获取相关，包括铁ABC转运通透酶和锌输入蛋白ZupT。此外，还鉴定了一个可能参与铁载体生物合成的异分支酸酶家族蛋白。通过补充或消耗铁和锌在营养丰富（TSB）和最小（M9）培养基中评估了金属可用性对细菌生长的影响。在TSB中，补充铁或锌导致OD600略有增加。然而，菌落形成单位（CFU）计数未显示生长增强。相反，添加2,2'-联吡啶以螯合铁或TPEN以螯合锌导致生长显著抑制，并且在重新添加相应金属后这种效应被逆转。在M9培养基中，铁补充或2,2'-联吡啶处理均未对活菌计数产生显著影响，表明在最小条件下E. tarda的生长基本不受铁可用性的影响。在M9培养基中，添加锌对生长参数没有显示出影响。然而，应用TPEN导致生长显著减少，这种现象通过重新添加锌得到挽救。这些结果强调了严格调控铁和锌获取对E. tarda体内存活的重要性。
In vivoattenuation of the ΔzupT mutant
为了验证锌摄取在E. tarda发病机制中的作用，我们构建了一个zupT缺失突变体，并在小鼠皮下感染模型中评估其毒力。存活分析显示，与野生型（WT）菌株相比，ΔzupT表现出显著降低的致死性。这些数据提供了直接的体内证据，证明锌获取有助于细菌在坏死性软组织感染期间的适应性。
DISCUSSION
我们的TraDIS筛选鉴定出多个与金属离子转运和稳态相关的基因对E. tarda在软组织感染期间的存活至关重要。值得注意的是，编码铁ABC转运通透酶的fepC和锌输入蛋白zupT是体内最显著耗竭的基因之一。这些发现强调了在宿主施加的营养限制下，铁和锌获取的关键作用，这种现象在深部组织感染中有充分记载。
在TraDIS筛选之前，我们建立了一个能准确反映NSTIs病理的可重复鼠感染模型。有趣的是，我们发现毒力受细菌预培养条件的强烈影响。虽然在37°C的TSB中生长的E. tarda对小鼠表现出可忽略的致病性，但在LaB中制备的培养物，特别是在25°C下，导致快速完全死亡。因此，我们观察到根据感染前培养基（LaB和TSB）和温度（25°C vs 37°C）的不同，小鼠存活率存在显著差异。显微镜观察进一步显示，在25°C的LaB中培养的E. tarda表现出最高的运动性，而在37°C的TSB中生长最旺盛。这种对比表明，环境预适应可能在感染前差异调节运动性和增殖。已知温度变化会影响细菌生理，包括表面结构和LPS组成的重塑、毒力相关基因的诱导以及代谢预适应。重要的是，我们之前的工作表明，运动性加速了嗜水气单胞菌鼠伤口感染模型中的坏死进展，并且趋化侵袭对于创伤弧菌的深部组织传播至关重要。总之，这些发现支持了温度依赖性运动性增强有助于E. tarda在NSTIs期间毒力潜能的假设。
几个与LPS生物合成和外膜稳定性相关的基因在体内显著耗竭。由于LPS既是结构成分，又是宿主免疫的主要靶点，这些发现表明维持包膜完整性对E. tarda在软组织中的存活至关重要。对于创伤弧菌和肠沙门氏菌也得出了类似的结论，其中LPS生物合成缺陷显著增加了对补体和抗菌肽的敏感性。我们还鉴定出在体内选择性耗竭的转录调控因子和应激反应基因。这些因子可能协调适应性程序，使E. tarda能够在营养限制和宿主来源的应激下重塑其代谢和包膜组成。类似的机制已在肠沙门氏菌和霍乱弧菌中描述，其中转录调控因子将环境线索与毒力基因表达整合。这些发现补充了我们对下面描述的营养获取途径的分析。
我们的筛选鉴定出关键代谢基因：pdxK（维生素B6）、cobA（维生素B12）和speB（多胺生物合成）。这些代表了TraDIS筛选中显著耗竭的类别，即微量营养素代谢和多胺利用。在M9最小培养基中补充吡哆醛或腐胺部分恢复了生长，证实了对这些微量营养素的功能需求。这支持了之前在UPEC和铜绿假单胞菌中的发现，这些发现强调了维生素和多胺代谢在宿主环境中的重要性。虽然我们尚未直接评估这些突变体的体内情况，但数据表明，在预期营养限制的软组织感染期间，获取吡哆醛、钴胺素和多胺有助于细菌适应性。有趣的是，虽然硫胺素（维生素B1）对中心代谢至关重要，但没有硫胺素生物合成基因在体内显著耗竭。一个硫胺素ABC转运蛋白基因适度富集但不显著。这可能表明硫胺素在坏死组织中不限制，或者冗余的摄取途径补偿了其获取。
尝试用单一营养素如甲硫氨酸、维生素B12或硫胺素在最小培养基中挽救E. tarda生长失败，表明营养缺陷不是由单一限制因素驱动。相反，增殖可能依赖于必需代谢物或营养丰富的宿主成分的组合可用性，可能通过组织损伤或共感染微生物释放。只有1.22%的转座子突变体在体内显示显著耗竭，清楚地表明E. tarda对宿主组织感染的适应涉及高度特化的代谢和营养获取途径，而非广泛的遗传决定因素。
铁作为能量代谢、DNA合成和氨基酸生物合成中酶的辅因子是不可或缺的。然而，在体内，铁被宿主蛋白（如转铁蛋白和乳铁蛋白）紧密隔离，为病原体创造了铁限制环境。观察到的fepC突变体衰减表明，需要铁转运蛋白来克服这种限制。与此一致，使用联吡啶螯合铁在体外损害了E. tarda生长，尤其是在最小条件下。然而，外源铁补充在丰富培养基中没有增强生长，表明铁可用性具有环境依赖性。
锌是另一种微量金属，对许多蛋白质的结构和催化功能至关重要。发现广谱金属转运蛋白ZupT对体内存活至关重要。补充实验证明，TPEN介导的锌螯合抑制细菌生长，而锌补充可挽救它，证实了ZupT在锌稳态和细菌适应性中的生理相关性。有趣的是，锌依赖性和锌非依赖性核糖体蛋白L36p变体，以及锌非依赖性L32p，在体内均显著耗竭。这表明E. tarda可能利用混合核糖体组成——包含经典和替代核糖体蛋白亚型——以在宿主组织中波动或限制的锌条件下维持翻译效率。类似的核糖体蛋白替换已在锌限制期间的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中描述，支持核糖体重塑是细菌应对宿主施加的营养免疫的保守策略的观点。这种核糖体重塑可能代表一种保守的细菌策略，用于在微量营养素应激下维持蛋白质合成。虽然ZupT在系统性或晚期锌限制下的存活是不可或缺的，但ΔzupT突变体在早期感染期间在肌肉组织中没有显示细菌负荷减少。这表明肌肉中的局部锌可用性足以维持初始细菌增殖，并且ZupT依赖性锌获取仅在感染进展且宿主施加更强的营养免疫后才变得关键。与这些发现一致，ΔzupT突变体在体内表现出显著降低的致死性。这提供了直接的实验验证，证明锌摄取对E. tarda在NSTIs期间的完全毒力是不可或缺的。
我们的发现挑战了经典的以毒素为中心的发病机制观点。我们还提出代谢适应性，特别是微量营养素获取，是E. tarda在NSTIs期间毒力的主要驱动力。在我们的TraDIS筛选中，经典的分泌毒力因子，如毒素和溶细胞素，在显著耗竭的突变体中不存在。然而，混合TraDIS实验的性质——其中同时接种多个转座子突变体——可能掩盖了分泌或可扩散毒力因子的影响。由未受影响菌株产生的此类细胞外因子可能在功能上补偿缺乏其产生的突变体，从而掩盖了它们在适应性筛选中的重要性。因此，已知毒素和分泌效应子在我们数据集中的缺失并不能明确排除它们在发病机制中的作用。需要额外的单突变体感染研究来严格评估分泌毒力决定因素的贡献。值得注意的是，在许多病原体中，通过铁摄取调节因子（Fur）的铁感应协调毒力基因（如分泌系统和细胞毒素）的表达。在E. tarda中，Fur调控途径可能将营养感应与毒力激活联系起来——这一假设值得进一步研究。总之，这些发现强调了在E. tarda诱导的NSTIs背景下，代谢适应相对于经典毒力因子表达的重要性。
总之，E. tarda通过一组特化的代谢和转运途径适应营养受限的环境。靶向这些适应性决定因素，特别是金属获取和维生素生物合成，可能为减轻坏死性感染中的组织损伤和阻止疾病进展提供新策略。我们的研究强调，代谢适应性，而非经典的以毒素为中心的毒力因子，是E. tarda引起暴发性NSTI的基础。
