《Nucleic Acids Research》：RNA G-quadruplexes promote codon repeat-associated ribosomal frameshifting in human genes
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本研究揭示了RNA G-四链体(rG4)作为关键顺式作用元件，在人类基因中广泛促进密码子重复相关核糖体移码(CRFS)的新机制。研究人员通过全基因组CRISPR筛选发现RNA结合蛋白RBM4能特异性结合HDAC1 mRNA中的rG4结构并增强其+1移码效率。实验证实rG4结构的稳定性和空间构象直接调控移码效率，且该机制在多种基因背景下具有普适性。该发现为理解真核生物翻译重编程提供了新视角，对揭示非经典蛋白质多样性产生机制具有重要意义。
在基因表达调控的复杂网络中，核糖体移码（ribosomal frameshifting）作为一种特殊的翻译重编程机制，长期以来被认为主要存在于病毒和原核生物中。然而近年来研究发现，这种机制在人类等真核生物中同样广泛存在，尤其是我们团队前期发现的密码子重复相关核糖体移码（codon repeat-associated ribosomal frameshifting, CRFS）现象，能够在多种人类组织中产生具有生物学功能的移码蛋白。但大多数短密码子重复序列自身并不能诱导高效的移码效率，暗示着其他顺式和反式作用元件的参与。
为了揭示CRFS的调控机制，发表在《Nucleic Acids Research》上的这项研究开展了系统性探索。研究人员首先构建了组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1, HDAC1）基因的CRFS报告系统，通过全基因组CRISPR筛选成功鉴定出RNA结合蛋白RBM4作为HDAC1移码的关键增强因子。进一步机制研究表明，RBM4通过特异性识别HDAC1 mRNA编码区中形成的RNA G-四链体（RNA G-quadruplex, rG4）结构来促进核糖体移码。
研究的关键发现是，位于HDAC1基因（UAC）3密码子重复下游的rG4结构是移码发生的核心元件。通过圆二色谱（circular dichroism, CD）分析证实该序列确实能够形成典型的平行G-四链体结构，且其稳定性受钾离子和rG4特异性配体的调控。点突变实验显示，破坏rG4关键鸟嘌呤位点会显著降低移码效率，而应用rG4稳定剂PhenDC3则能增强移码。
尤为重要的是，这种rG4介导的移码促进效应具有普适性。将HDAC1来源的rG4序列插入其他基因（如LRRC17、SETD2等）的密码子重复下游，均能显著提升其移码效率。同时，来自不同基因背景的rG4结构（如NRAS、Trf2和TERRA）也展现出类似的移码促进功能。全基因组分析进一步发现，rG4 motifs在密码子重复下游区域显著富集，质谱分析数据中鉴定出48个潜在的rG4介导CRFS事件，其中3个代表性位点（FOXO3、HAX1和CRACR2B）的实验验证均支持rG4在移码中的关键作用。
技术方法方面，研究主要采用双荧光素酶报告系统定量评估移码效率，结合全基因组CRISPR筛选鉴定调控因子；运用RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）验证RBM4与靶RNA的相互作用；通过体外转录翻译系统（兔网织红细胞裂解物和粗糙脉孢菌裂解物）验证rG4的功能独立性；利用圆二色谱分析rG4结构特征；并整合核糖体图谱（ribosome profiling）数据和质谱分析（mass spectrometry）进行基因组水平验证。
主要研究结果
RBM4通过结合rG4促进HDAC1移码
研究人员首先构建了基于HDAC1 CRFS序列的双荧光报告系统，通过全基因组CRISPR筛选发现RBM4是HDAC1移码的关键正调控因子。RNA免疫共沉淀实验证实RBM4能特异性结合HDAC1 mRNA中的rG4区域。核糖体图谱分析显示，rG4结构上游存在明显的核糖体滞留现象，提示rG4可能通过引起核糖体停滞而促进移码。
rG4是HDAC1移码的关键顺式元件
通过定点突变HDAC1中的rG4形成序列，发现破坏G-tracts会显著降低移码效率。体外翻译实验进一步验证了这一结果。使用rG4稳定剂PhenDC3处理可增强移码，而 destabilizer TMPyP4则抑制移码，证明rG4结构的稳定性直接调控移码效率。
rG4介导的移码促进具有普适性
将HDAC1来源的rG4序列插入LRRC17、SETD2等基因的密码子重复下游，能显著提升这些基因的移码效率。不同来源的rG4结构（NRAS、Trf2、TERRA）在多种基因背景下均展现出移码促进功能，表明rG4作为移码促进元件的普遍性。
基因组水平验证rG4与CRFS的关联
生物信息学分析显示，rG4 motifs在密码子重复下游区域显著富集。基于人类蛋白质组数据的筛选鉴定出34个基因中的48个潜在rG4介导CRFS位点，其中FOXO3、HAX1和CRACR2B三个位点的实验验证证实了rG4在移码中的关键作用。
研究结论与意义
本研究系统阐明了编码区rG4结构作为一种新型翻译重编程元件的分子机制。发现RBM4-rG4调控轴在CRFS中的核心作用，不仅拓展了对真核生物基因表达调控机制的认识，也为理解非经典蛋白质产生的多样性提供了新视角。rG4介导的移码促进效应在多种基因背景下的普适性，提示这可能是真核生物中一种较为保守的基因表达调控策略。该研究为后续探索rG4在生理病理条件下的功能，以及开发基于rG4的基因表达调控工具奠定了重要基础。
