《Nucleic Acids Research》：Illuminating the genome: emerging approaches in CRISPR-Cas live-cell imaging
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本研究聚焦CRISPR-Cas活细胞基因组成像技术，针对非重复序列信号弱、背景噪音高等难题，系统综述了多色标记策略、信号放大系统（如SunTag、Casilio）及背景抑制方法（如CRISPR/Pepper-tDeg）的最新进展。通过优化dCas9与sgRNA工程，显著提升了信背比并实现了单拷贝位点的动态追踪，为揭示染色质三维结构与基因调控的关联提供了强大工具，但需警惕长时间表达引发的复制应激和基因组不稳定性风险。
理解基因组在细胞核内的三维空间组织及其随时间动态变化，是连接染色质结构与基因调控、细胞命运转变及疾病发展的核心。传统技术如染色体构象捕获（Hi-C）和荧光原位杂交（FISH）虽能绘制基因组架构，但仅适用于固定样本，无法捕捉活细胞中染色质的实时动态。早期活细胞基因位点标记方法（如LacO/TetO系统）需复杂的基因组工程，且难以实现多色复用成像。CRISPR-Cas技术的出现彻底改变了这一局面：通过将核酸酶失活的Cas9（dCas9）与向导RNA（sgRNA）结合，可在活细胞中特异性标记并追踪基因组位点。然而，早期技术仅能高效标记端粒、着丝粒等重复序列，对单拷贝非重复序列的成像仍因信号弱、背景高而面临挑战。
为突破这些限制，研究人员开发了多色成像、信号放大及背景抑制策略。多色成像主要通过两种路径实现：一是利用正交Cas变体（如化脓链球菌、脑膜炎奈瑟菌和嗜热链球菌的dCas9），各自携带不同荧光标签独立标记位点；二是通过工程化sgRNA支架（如CRISPRainbow系统），在sgRNA中插入MS2、PP7等RNA适体，招募不同荧光蛋白实现多色标记。信号放大方面，蛋白中心策略如SunTag系统将dCas9与24个GCN4肽段融合，招募单链抗体-荧光蛋白复合物，使信号增强约20倍；RNA中心策略如Casilio系统则通过sgRNA上的Pumilio结合位点（PBS）招募可编程PUF结构域-荧光蛋白，提升信背比。针对非重复序列成像，研究者或通过密集排列sgRNA（如CRISPR-delight利用Cas12a阵列自然加工多个crRNA），或采用背景抑制技术如CRISPR/Pepper-tDeg，后者通过降解未结合荧光蛋白（FP-tDeg）显著降低背景，实现单sgRNA标记单拷贝位点。
尽管技术进步显著，CRISPR成像仍存在复制干扰、染色质重塑副作用及持续表达导致的细胞负担等风险。例如，dCas9可能阻碍复制叉进展并诱发DNA损伤响应；过度表达还会引发p53依赖的细胞周期停滞。未来需开发更紧凑、可诱导的成像系统，并整合超分辨显微技术，以在低扰动下实现长时程、多维度基因组动态监测。
关键技术方法概述
研究通过多色标记策略（正交Cas变体与sgRNA支架）实现多位点同步追踪；利用信号放大系统（SunTag、Casilio等）提升重复/非重复序列的信背比；采用背景抑制技术（如split-FP、CRISPR分子信标）增强成像对比度；通过预组装核糖核蛋白（RNP）递送（如LiveFISH）实现瞬时、低毒性标记。部分实验涉及人类HeLa细胞系及初级细胞样本。
研究结果
1. 多色成像策略扩展应用场景
正交Cas系统（如dCas9-Spy、dCas9-Sau等）与工程化sgRNA支架（如MS2/PP7适体）成功实现哺乳动物细胞中2-7种颜色的同步标记，支持染色体空间关系定量分析。但该方法受限于正交变体的PAM序列要求及多蛋白表达负担。
2. 信号放大技术提升检测灵敏度
SunTag系统通过多肽 epitope 阵列招募scFv-FP，使端粒等重复序列信号增强20倍；split-FP设计（如三片段GFP互补）将信背比提升6倍，有效降低游离荧光背景。RNA支架优化（如CRISPR-Sirius的8×MS2）显著提升低重复序列亮度，但长sgRNA可能影响核定位。
3. 非重复序列成像实现单拷贝追踪
通过多重sgRNA递送（如CRISPR-delight的Cas12a阵列）或背景抑制策略（如CRISPR/Pepper-tDeg），仅需3-10个sgRNA即可标记MUC4等单拷贝位点。相分离辅助系统（如CRISPR-FISHer）通过FUS低复杂度结构域凝聚信号，但存在扰动染色质风险。
4. 成像技术伴随生物学扰动风险
dCas9长时间结合可能阻滞复制叉，诱发γH2AX聚焦点；结合染色质开放区域可能改变局部可及性。表达水平调控（如诱导型启动子）和RNP递送可减轻细胞毒性。
结论与展望
CRISPR-Cas活细胞成像技术已从概念验证发展为揭示基因组动态的强大工具，其多色复用、信号放大和背景抑制策略极大拓展了非重复序列的可视化能力。然而，信背比与细胞扰动的平衡仍是核心挑战。未来需聚焦“智能”激活型探针、紧凑型效应器开发，并建立标准化毒性评估流程。结合超分辨显微术与机器学习分析，该技术有望在发育、疾病模型中动态解析染色质运动与基因表达的因果关联，推动四维基因组学进入定量时代。
