模板切口通过R-loop介导的链置换抑制体外转录中启动子非依赖性反义转录

《Nucleic Acids Research》：Template nicking suppresses promoter-independent antisense transcription in IVT via R-loop-mediated strand displacement

本研究针对T7 RNA聚合酶体外转录(IVT)合成mRNA时产生免疫原性双链RNA(dsRNA)副产物的难题，开发了切口低dsRNA模板(NiLoT)策略。通过在非模板链引入特异性单链切口促进R-loop形成，有效抑制了从DNA末端启动的反义转录，使dsRNA污染降低80%且不影响RNA产量。该技术显著提升mRNA翻译效率并降低细胞免疫激活，为高质量治疗性mRNA生产提供了创新解决方案。

　　

随着SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功应用，基于信使RNA(mRNA)的疗法开发进入快车道，而体外转录(IVT)技术作为合成mRNA的核心手段，其产品质量直接关系到治疗效价与安全性。然而，使用T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)进行IVT时，总会伴随产生免疫刺激性的双链RNA(dsRNA)副产物，这些杂质不仅会降低mRNA的翻译效率，还会通过激活细胞内模式识别受体（如TLR3、RIG-I、MDA5）和dsRNA应答酶（如蛋白激酶R），引发I型干扰素(IFN)产生，最终损害mRNA稳定性与治疗效果。

机制研究表明，dsRNA主要来源于启动子非依赖性反义转录——T7 RNAP在缺乏T7启动子序列的平末端或突出端线性DNA末端异常启动反义RNA合成，这些反义转录本与正义RNA退火形成完全互补的dsRNA双链。虽然目前已有通过调整反应条件（如降低MgCl₂浓度）或改造T7 RNAP来减少dsRNA的策略，但这些方法往往导致RNA产量下降、工艺复杂性增加或规模化生产受限，且大多未靶向驱动反义转录的暴露DNA末端。

为解决这一技术瓶颈，韩国建国大学的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表创新性研究，提出了一种名为"切口低dsRNA模板(NiLoT)"的模板工程策略。该方法的巧妙之处在于：通过在非模板DNA链的特定位点引入单链切口，利用转录过程中R-loop（RNA:DNA杂交体）的形成驱动链置换，物理阻遏反义转录在DNA末端的启动，从而从源头上抑制dsRNA生成。

为验证NiLoT的有效性，研究人员构建了多种DNA模板（包括全长双链、部分单链及特异性切口模板），通过琼脂糖凝胶电泳、J2抗体点杂交（特异性检测dsRNA）、S9.6抗体点杂交（特异性检测RNA:DNA杂交体）等技术系统评估了dsRNA形成情况。同时建立S1核酸酶保护实验来监测链置换效率，并通过流式细胞术、荧光显微镜和ELISA等方法在HEK293T和THP-1细胞中检测mRNA的翻译输出和免疫激活水平。

研究结果显示，NiLoT策略能显著降低dsRNA污染（降幅达80%），且不牺牲RNA产量。当切口位于非模板链3'末端约400核苷酸范围内时，可有效促进R-loop形成和链置换，使下游非模板链被置换，从而阻止反义转录启动。该策略适用于不同模板形式（PCR扩增产物或线性化质粒）、长转录本（3.9 kb SARS-CoV-2刺突蛋白mRNA）、多种T7 RNAP（野生型和工程化低dsRNA变体）及常见核苷酸修饰（如Ψ、m¹Ψ、m⁵C），展现出良好的普适性。

功能实验证实，与常规双链DNA模板相比，NiLoT衍生的mRNA在多种核苷酸修饰条件下均能提高增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达水平，其中N1-甲基假尿苷(m¹Ψ)修饰显示协同增强效应。更重要的是，NiLoT-mRNA显著降低了HEK293T和THP-1细胞中的IFN-β分泌，表明其免疫原性大幅降低。即使经过标准DNase I处理后，NiLoT制备的RNA也几乎不激活先天免疫应答，证实dsRNA是主要免疫刺激污染物，而模板工程策略能有效解决此问题。

本研究的关键技术方法包括：模板切口工程（通过Nt.Bpu10I核酸内切酶或Cas9 D10A切口酶实现）、体外转录优化、核酸酶消化分析（S1核酸酶、RNase III）、点杂交检测（J2抗dsRNA抗体、S9.6抗RNA:DNA杂交体抗体）、S1核酸酶保护实验（检测链置换）以及细胞功能验证（流式细胞术、ELISA）。

模板切口抑制dsRNA形成同时保持RNA产量

通过比较部分单链DNA、NiLoT（切口位于非模板链3'末端211 nt处）和完全双链DNA模板的转录产物，发现NiLoT能显著降低dsRNA水平，且RNA总产量与完整性（RINe=10.0）与双链模板相当。切口位置实验表明，当切口位于非模板链3'末端400 nt范围内时，dsRNA抑制效果最佳；超过此距离，抑制效率随切口位置上移而降低。

R-loop形成驱动NiLoT模板中的链置换

时间进程实验显示，NiLoT模板的RNA:DNA杂交信号随时间增加，60分钟时达到平台期，而双链模板仅显示基础水平。S1核酸酶保护实验进一步证实，NiLoT转录30分钟后出现显著的单链DNA探针保护信号，表明链置换确实发生。这些结果支持了"切口促进R-loop形成，进而驱动链置换"的机制假说。

NiLoT在不同IVT条件下保持dsRNA抑制效果

无论是PCR扩增的线性DNA还是含有5'突出端和poly(A)尾的线性化质粒模板，NiLoT均能有效降低dsRNA水平。对于3.9 kb的长转录本，NiLoT同样表现出良好的抑制效果。与野生型T7 RNAP相比，工程化低dsRNA变体本身能减少dsRNA形成，而结合NiLoT后可进一步降低dsRNA水平。在化学修饰核苷酸存在下，NiLoT与Ψ、m¹Ψ、m⁵C等修饰协同降低dsRNA，且不与尿素的混沌效应策略冲突。

NiLoT改善mRNA功能并降低免疫原性

细胞实验表明，NiLoT衍生的mRNA在所有测试的核苷酸修饰条件下均显示更高的eGFP表达，其中m¹Ψ修饰效果最显著。相反，m⁶A修饰的mRNA无论模板来源均无荧光信号，提示过度m⁶A修饰可能损害翻译。免疫激活检测发现，NiLoT-mRNA在HEK293T和THP-1细胞中诱导的IFN-β分泌均显著低于双链DNA模板产物。选择性核酸酶消化实验证实，标准DNase I处理后，NiLoT制备的RNA中dsRNA是主要免疫刺激物，而RNA:DNA杂交体贡献可忽略。

本研究开发的NiLoT策略通过模板工程巧妙控制了T7 RNAP的转录极性，从源头上减少了dsRNA副产物的生成。与现有方法相比，该技术不改变标准IVT反应条件，兼容多种模板格式、转录酶变体和核苷酸修饰，易于整合到现有mRNA生产工艺中。值得注意的是，NiLoT产生的RNA:DNA杂交体可通过常规DNase I处理有效去除，不会引入新的免疫原性风险。这项研究为高质量治疗性mRNA的规模化生产提供了简单、可扩展的解决方案，有望推动mRNA技术在疫苗开发、蛋白质替代疗法和基因治疗等领域的更广泛应用。