《Nucleic Acids Research》：Strategic variations in sarbecovirus and merbecovirus Nsp1 linker regions for translation inhibition
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本研究针对冠状病毒关键毒力因子非结构蛋白1（Nsp1）在不同病毒谱系（sarbecovirus与merbecovirus）中抑制宿主翻译的分子机制差异。研究人员通过解析四种野生动物来源冠状病毒Nsp1与40S核糖体亚基的冷冻电镜结构，发现尽管Nsp1的C端结构域（CTD）均稳定结合于mRNA进入通道，但40S头部结构域仍保留约5°的旋转自由度。研究首次揭示sarbecovirus采用较长且受限的连接区（linker），而merbecovirus采用较短柔性连接区，这种连接区长度与构象差异直接调控翻译抑制效率，为理解冠状病毒宿主关闭机制及广谱抗病毒策略开发提供了新视角。
在过去的二十年间，冠状病毒引发了三次重大疫情，持续威胁全球公共卫生安全。理解病毒生命周期中的保守机制、鉴定广谱抗病毒靶点至关重要。非结构蛋白1（Nsp1）作为冠状病毒的关键毒力因子，在抑制宿主免疫应答、劫持宿主翻译机器以优先合成病毒蛋白方面扮演核心角色。然而，不同冠状病毒谱系的Nsp1蛋白抑制宿主基因表达的分子机制是否存在差异，其结构基础是什么，仍是未解之谜。为了解决这些问题，研究人员将目光投向了野生动物来源的冠状病毒，试图揭示Nsp1蛋白在抑制宿主翻译过程中的保守机制与谱系特异性策略。
本研究聚焦于来自野生动物的四种冠状病毒Nsp1蛋白，涵盖sarbecovirus（蝙蝠RaTG15和穿山甲MpCoV-GX）和merbecovirus（蝙蝠NeoCoV和NL140422）两个谱系。研究人员发现，这四种Nsp1蛋白均能在人源细胞中抑制宿主蛋白合成，而病毒的5'非翻译区（5'UTR）能够介导翻译抑制逃逸。为了阐明其结构基础，研究团队利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了这四种Nsp1蛋白与40S核糖体亚基的复合物结构。令人惊讶的是，数据处理过程中，每个Nsp1-40S复合物都获得了两种高分辨率结构模型，揭示了此前未被报道的结构动态特性。相关研究成果发表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上。
为开展研究，作者团队主要应用了以下关键技术方法：利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了四种野生动物来源冠状病毒（RaTG15, MpCoV-GX, NeoCoV, NL140422）的Nsp1蛋白与40S核糖体亚基的复合物结构，获得了两种构象状态；通过分子克隆技术在原核系统（大肠杆菌）中表达并纯化了全长Nsp1及其N端结构域（NTD）；利用哺乳动物细胞（HeLa, HEK293T）进行荧光素酶报告基因实验和流式细胞术，评估Nsp1及其突变体对宿主翻译的抑制效率以及病毒5'UTR的逃逸能力；通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证Nsp1 NTD与病毒5'UTR RNA的相互作用；并进行了生物信息学分析，包括序列比对、系统发育分析和Nsp1 NTD与SL1 RNA相互作用的计算模拟。
Nsp1对宿主蛋白翻译的抑制作用
研究人员首先评估了不同β-冠状病毒Nsp1蛋白抑制宿主蛋白合成的能力。序列比对显示，Nsp1的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）相对保守，而连接这两个结构域的连接区（linker）在sarbecovirus和merbecovirus之间存在明显差异：merbecovirus Nsp1的连接区较短，尽管其整体蛋白长度更长。细胞实验表明，所有六种测试的冠状病毒（包括SARS-CoV-2、RaTG15、MpCoV-GX、MERS-CoV、NeoCoV和NL140422）的Nsp1蛋白均能显著抑制报告基因（荧光素酶）的表达，但抑制效率存在谱系差异。Sarbecovirus Nsp1蛋白表现出更强的抑制能力，而merbecovirus Nsp1的抑制效果相对较弱，且这种抑制具有剂量依赖性。
40S核糖体头部在Nsp1结合后仍保持旋转灵活性
通过冷冻电镜解析的Nsp1-40S复合物结构显示，每种复合物都存在两种构象状态（状态1和状态2）。这两种状态的主要区别在于40S核糖体头部结构域发生了约4.5°至4.8°的旋转，这表明Nsp1的CTD虽然稳定地结合在mRNA进入通道内，但并未完全限制核糖体头部结构域的移动自由度。这种旋转现象在sarbecovirus和merbecovirus的复合物中均被观察到。此外，CTD中第二个螺旋（helix 2）的定位在sarbecovirus和merbecovirus的Nsp1蛋白中存在差异，揭示了谱系特异性的结构变异。
Nsp1 CTD与核糖体mRNA通道的相互作用
核糖体mRNA通道由核糖体蛋白uS3、uS5以及18S rRNA的螺旋18（h18）组成，是Nsp1 CTD的主要结合位点。研究发现，CTD通过保守的“KH/KY/KF”基序与核糖体成分形成稳定的相互作用，包括疏水作用和静电作用。尽管头部旋转影响了Nsp1 CTD与uS3的相互作用距离，但并未将CTD从mRNA进入通道中置换出来。状态2的复合物构象更类似于mRNA门闩（latch）的“关闭”状态，而状态1则类似于“开放”状态，提示这种构象变化可能与mRNA扫描和加载的调控有关。
连接区模式影响Nsp1的翻译抑制效率
在RaTG15 Nsp1-40S状态1复合物中，研究人员解析出了部分Nsp1连接区结构，发现该区域与核糖体蛋白uS3存在稳定的相互作用。然而，在状态2中，连接区呈现无序状态，表明其灵活性增加。结构比较揭示了连接区在sarbecovirus和merbecovirus Nsp1中的显著差异：sarbecovirus Nsp1具有较长的连接区，且其构象因N端螺旋1末尾的保守脯氨酸而受到限制；merbecovirus Nsp1的连接区较短，但灵活性更高。功能实验表明，缩短sarbecovirus Nsp1的连接区会降低其翻译抑制效率，而延长merbecovirus Nsp1的连接区则对其功能影响不大。连接区互换嵌合体实验进一步证实，sarbecovirus Nsp1的功能对其自身较长的连接区有依赖性。此外，缩短连接区也降低了sarbecovirus Nsp1介导的宿主mRNA降解效率，提示连接区长度可能通过影响NTD的灵活性来调节其功能。
病毒5'UTR介导的翻译抑制逃逸
病毒的5'UTR能够帮助病毒mRNA逃逸Nsp1介导的翻译抑制。本研究证实，所有六种测试冠状病毒的5'UTR均能在其同源Nsp1存在的情况下显著促进报告蛋白的表达。更重要的是，这种逃逸功能表现出一定的交叉反应性，即异源病毒的5'UTR也能在一定程度上介导逃逸。电泳迁移率变动分析（EMSA）和计算模拟分析表明，所有六种Nsp1的NTD都能与各种病毒的5'UTR相互作用，其保守的NTD构象和5'UTR中茎环1（SL1）元件的相对保守性为这种交叉逃逸提供了结构基础。
研究结论与意义
本研究通过结构生物学、生物化学和细胞生物学方法，系统比较了不同冠状病毒谱系Nsp1蛋白的结构与功能。研究发现，尽管Nsp1 CTD以保守的方式结合于核糖体mRNA进入通道，但核糖体头部仍保留一定的旋转自由度。这种旋转会重新定位Nsp1的连接区，进而可能影响其NTD的空间动态。研究首次揭示了sarbecovirus和merbecovirus的Nsp1在连接区长度和构象上存在谱系特异性策略：sarbecovirus采用较长且构象受限的连接区，这对维持其高效的翻译抑制功能至关重要；merbecovirus则采用较短但更灵活的连接区，能更好地适应核糖体的构象变化。连接区的这些特性直接调控了Nsp1的翻译抑制效率和mRNA降解效率。此外，病毒5'UTR介导的翻译逃逸机制在β-冠状病毒中较为保守。这些发现不仅深化了对冠状病毒Nsp1调节宿主基因表达分子机制的理解，揭示了其进化适应策略，而且为未来针对保守的Nsp1-核糖体相互作用开发广谱抗病毒策略提供了重要的结构基础和理论依据。连接区和CTD螺旋的变异模式还可能作为病毒分类的分子标记。
