《ACS Omega》：A Validated Method for the Simultaneous Measurement of Tryptophan, Kynurenine, Phenylalanine, and Tyrosine by High-Performance Liquid Chromatography–Ultraviolet/Fluorescence Detection in Human Plasma and Serum
引言
芳香族氨基酸（Aromatic amino acids, AAs），如苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr），不仅是蛋白质的基本组成单位，还是众多生物活性分子的前体，这些分子参与神经传递、免疫调节和氧化还原稳态。其代谢失调与多种病理状况相关，包括感染、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、恶性肿瘤和精神疾病。因此，可靠地测定生物体液中这些氨基酸及其比值对于研究、诊断和个性化医疗具有重要意义。
其中，色氨酸-犬尿氨酸（Trp-Kyn）通路尤为关键。Trp是几种生物合成途径的前体，包括神经递质血清素的合成，后者在情绪调节和各种生理功能中起关键作用。Trp-Kyn通路代谢了人体内超过95%的Trp，产生犬尿酸、黄尿酸和烟酰胺等代谢物。肝外的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）1和2以及肝内的色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）能够催化该通路的第一步也是限速步骤，即N-甲酰犬尿氨酸的形成，随后水解为更稳定的Kyn。Kyn可进一步代谢为犬尿酸、邻氨基苯甲酸或3-羟基犬尿氨酸。IDO-1主要由促炎细胞因子（尤其是干扰素-γ）诱导产生，主要存在于单核细胞来源的细胞以及其他免疫和非免疫细胞中。外周血细胞中IDO-1的诱导导致Trp水平降低和Kyn水平升高，通常被视为细胞免疫激活的指标。在病毒感染、神经退行性疾病、各种恶性肿瘤、代谢和神经精神疾病患者的血清和血浆中，均已报道存在Trp分解代谢失调和Kyn下游代谢物水平的变化。早在20世纪90年代初，Kyn与Trp的比值（Kyn/Trp）就被提议在伴有其他免疫激活标志物（如新蝶呤）升高时，可作为IDO酶活性的估算指标。
Phe-Tyr通路为了解炎症相关AA代谢变化提供了补充视角。Phe转化减少是炎症和氧化应激的非特异性指标，在创伤、脓毒症、癌症和未接受治疗的HIV患者中均有代谢失调的报道。Phe向Tyr的转化由苯丙氨酸羟化酶（PAH）催化，该酶需要辅因子四氢生物蝶呤（BH4）。BH4也是从Tyr生物合成儿茶酚胺前体L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）以及血清素合成所必需的。BH4化学性质不稳定，易于发生不可逆氧化。慢性炎症条件下BH4的丢失可能会损害神经递质的合成。炎症相关的神经递质前体代谢谱变化可能促进神经精神症状的发展。由于BH4本身的分析前处理和测量非常困难，Phe与Tyr的比值（Phe/Tyr）常被用作PAH活性的替代标志物。
目前存在多种分析氨基酸的方法，包括毛细管电泳、气相色谱或高效液相色谱（HPLC），并结合紫外（UV）、电化学、荧光或质谱检测。传统上，AA血清浓度通过HPLC和茚三酮衍生化后进行光度法测量，但这种方法可能耗时较长。然而，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）因其高特异性和较短的分析时间已成为首选技术。尽管如此，AA的弱电离和可能的基质效应可能导致精密度下降。MS技术通常需要昂贵的设备和专门的实验室，并且定量限通常并不优于传统技术。衍生化可以克服弱电离的问题，但可能会增加结果的变异性，这在实验室间研究中已有报道。相关因素包括衍生物不稳定、试剂干扰、衍生化不完全、副反应、分析时间长和色谱图中出现额外峰段。当使用粗提物时，这些复杂性进一步加剧，凸显了对简单样品制备、短分析时间和高灵敏度的需求，以提高AA分析的可靠性。
基于两种成熟经典方法的组合，我们提出了一种快速、准确的HPLC-UV/FLD方法，用于同时分析人血清和血浆中的Trp、Phe、Tyr和Kyn，无需衍生化步骤。该方法利用Trp、Phe和Tyr的天然荧光以及Kyn的紫外吸收进行检测。这为那些对设备和样品制备要求高的方法提供了一种经济有效且直接的替代方案，非常适合在研究型和临床实验室中实施。
材料与方法
化学品
标准品L-色氨酸（L-Trp）、L-犬尿氨酸（L-Kyn）、L-酪氨酸盐酸盐（L-Tyr HCl）、L-苯丙氨酸（L-Phe）和硝基酪氨酸（NT，内标，IS）购自奥地利维也纳的Sigma-Aldrich公司。除非另有说明，所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich。白蛋白购自德国海德堡的Serva Electrophoresis GmbH公司。三氯乙酸购自德国卡尔斯鲁厄的Carl Roth公司。去离子水使用德国哥廷根的Sartorius纯化系统制备。
血清和血浆
使用来自因斯布鲁克大学医院中心输血与免疫学研究所献血者的匿名剩余血液，这些献血者同意将剩余血液用于科学目的，用于基质制备和比较分析。
血浆基质制备：将含有柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖作为抗凝剂的采血袋中的全血储存于24°C以下过夜。血浆通过在4°C下以1730 g离心全血10分钟制备，然后储存于-20°C。仅使用无法用于输血的终止献血的全血。
血清基质制备和实验室间比较：将献血者的全血采集到Vacuette CAT血清促凝管中。血样在4°C冷却并避光保存。次日，在进行常规感染血清学检测之前，将血样在10°C下以3916 g离心10分钟。从每位献血者收集约500 μL通过分析线后的血清。将80份血清样本混合，以确保有足够的血清用于基质制备。
基质制备
通过向30 mL血浆和30 mL血清中各加入1.68 g活性炭来制备炭吸附血浆（CDP）和炭吸附血清（CDS）。样品在室温下于旋转培养箱中混合5小时，或者 alternatively 在4°C下过夜。将血浆/血清在4°C下以5125 g离心15分钟，上清液通过无菌过滤器（0.2 μm）过滤。将吸附后的血浆/血清分装并储存于-20°C。通过将35 g白蛋白和4.5 g NaCl溶解于500 mL去离子水中，制备7%（w/v）人血清白蛋白溶液，作为与人血清和血浆总蛋白含量匹配的替代基质。
样品制备
将AA的储备溶液配制在白蛋白溶液和去离子水中，分装后于-20°C保存直至使用。校准品混合溶液在每次测量前新鲜制备，方法是加入等体积新鲜解冻的L-Trp、L-Kyn、L-Tyr盐酸盐和L-Phe储备液，使Trp、Tyr、Phe的最终浓度达到200 μM，Kyn达到20 μM。
通过将已知体积的工作储备液与白蛋白、CDP或CDS混合来制备质控（QC）样品和对照样品，以获得相对于校准范围（表1或所示）的两种不同浓度（低浓度和高浓度）。QC样品和对照样品在分析前储存于-20°C，但至少储存24小时。
表1. 质控（QC）样品浓度
（Kyn低浓度1.5 μM，高浓度15 μM；Phe、Trp、Tyr低浓度15 μM，高浓度150 μM。浓度根据其在人类血液样本中的出现情况（较低和较高浓度范围）选择。）
使用NT作为内标（IS），通过将500 μM的工作储备液在去离子水中稀释至最终浓度25 μM来制备。将每种校准品混合溶液、质控样品或真实样品的100 μL与100 μL IS混合。通过加入25 μL 2 M三氯乙酸沉淀蛋白质。立即涡旋混合试管，并在室温下以16060 g离心10分钟。将上清液转移至新管中，再以16060 g离心10分钟。将上清液转移至HPLC进样瓶中以备分析。
基于RP-18和UV/FLD检测的HPLC方法
方法验证在配备1260 Infinity Degasser、1260 Series四元泵、1260自动进样器、1260柱温箱、1260 Series二极管阵列检测器（DAD）和1260荧光检测器（参考实验室，仪器1）的Agilent 1260 Infinity II LC系统上进行。为评估实验室精密度，样品在配备1100 degasser、1100 Series四元泵、1100 Series二极管阵列检测器和1100荧光检测器（参考实验室，仪器2）的Agilent 1100系统上测量。
AA在Merck Purospher STAR RP-18 (3 μm) LiChroCART 55–4色谱柱上进行分析，该色谱柱由Phenomenex100 RP-18 (5 μm) LiChroCART 4–4内径保护柱保护。在注入30 μL样品体积后，使用等度洗脱，以15 mM、pH 4.6的磷酸二氢钾（KH2PO4）为流动相，流速1.1 mL/min，在25°C下运行10分钟。Kyn和NT在360 nm波长下检测。Tyr和Phe在激发波长210 nm、发射波长302 nm（1-5分钟）下通过荧光检测；Trp在286/366 nm（ex/em）（5-10分钟）下检测。NT在UV和荧光通道中均用作内标。对照测量显示荧光色谱图中无额外峰，证实了Kyn和NT在用于Trp、Phe和Tyr的激发/发射波长下不可检测。Kyn在365/480 nm处仅显示弱荧光，而NT由于其芳香环上的硝基猝灭而基本上无荧光。数据使用OpenLab CDS Data Analysis 3.4收集和处理。
实验室间评估进行如下：（i）使用相同的方法，其中色谱柱、溶剂、校准品和QC样品由主导实验室提供，并在Shimadzu LC-40 HPLC上测量（外部实验室1）。（ii）此外，使用了基于离子交换树脂和茚三酮衍生化的HPLC方法（外部实验室2），其中血清样品按照先前报道的方法使用自动化氨基酸分析仪（Biochrom 30+）进行制备和分析。
方法验证方案
方法验证使用德国毒理和法医化学学会（GTFCH）的验证指南进行。该方法针对选择性、线性、日内和日间精密度、在白蛋白溶液（用作验证基质）、CDP或CDS中的准确度，以及在白蛋白中的稳定性和回收率进行了验证。
选择性：通过分析来自三个不同批次的白蛋白空白样，以及来自三个不同健康供体的血浆和血清，验证了方法的选择性。测量了不含IS的六个空白样以及含有IS的白蛋白、血浆和血清空白样。然后将这些结果与含有所有四种分析物（包括IS）的标准混合物的空白基质进行比较。
校准：校准范围设定为覆盖真实样品中分析物的预期浓度水平。为此，通过在三种不同的空白基质样品（白蛋白、CDP和CDS）中添加不同浓度水平的分析物来制备校准品，确保最低浓度等于定量下限（LLOQ），最高浓度在定量上限（ULOQ）之内。将峰面积比（分析物/IS）对校准范围内的不同浓度作图，并对每种分析物在所有基质中使用线性回归。八次独立测量的线性回归分析为每种分析物在所有基质中产生了方程和决定系数（R2）（表2）。使用Grubbs检验统计量（G）进行异常值检测。该检验在每个浓度水平从八次测定获得的数据上进行。显著性水平设定为95%（α < 0.05）。
表2. 白蛋白、炭吸附血浆（CDP）和炭吸附血清（CDS）中的验证结果总结，包括保留时间、校准范围、线性方程、决定系数（R2）、检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）
（例如，在白蛋白中：Kyn保留时间3.1分钟，校准范围0.31–20 μM，线性方程y = 15.59x – 0.07，R20.999，LOD 0.08 μM，LLOQ 0.31 μM；Phe保留时间3.2分钟，校准范围1.56–200 μM，y = 2644.24x – 0.26，R20.994，LOD 0.39 μM，LLOQ 1.56 μM；Trp保留时间7.9分钟，校准范围0.08–200 μM，y = 8.43x – 0.22，R20.996，LOD 0.01 μM，LLOQ 0.08 μM；Tyr保留时间1.5分钟，校准范围0.78–200 μM，y = 223.94x – 0.50，R20.996，LOD 0.08 μM，LLOQ 0.39 μM。在CDP和CDS中也获得了类似数据。）
检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）分别基于信噪比（S/N）为3和10确定。使用OpenLab软件的峰峰值（P2P）方法计算S/N比；对每个峰在固定时间区域内进行基线扣除。
准确度和精密度：为评估方法的准确度，制备了一系列QC样品。这些QC样品设计为覆盖相对于校准范围的低浓度和高浓度水平。在八个不同的日子里，每个浓度水平至少分析两个QC样品。这为分析白蛋白、CDP和CDS基质中代谢物的方法精密度提供了可靠评估。使用各自在白蛋白、CDP或CDS中的线性校准计算AA的浓度。
偏差：通过比较QC样品测量值在8天内的平均值与接受的参考值，计算系统误差（偏差）的百分比。
重复性：计算重复性标准偏差（RSDr）以评估单日内测量的精密度或重复性。
时间差异中间精密度：计算RSD(T)（时间差异中间精度的重复性标准偏差）以估计对同一样品重复分析或跨多天（每天涉及多次重复）测量获得的测量结果的可靠性。此外，还计算了95% β-容忍区间。
通过在不同的HPLC设备上测量QC样品、由不同操作员制备QC样品、以及在不同实验室（不同操作员和设备）制备和测量QC样品来确定实验室精密度。
稳定性：通过制备白蛋白中低浓度和高浓度水平的6个对照样品，将它们混合，然后再次制备6个等分试样，并在相当于常规分析序列预期长度的持续时间内定期测量，来确定处理后样品的稳定性。
通过比较经历了三次冻融循环的低浓度和高浓度对照样品与未经历冻融循环的对照样品，来确定冻融稳定性。
回收率和提取效率：通过分析白蛋白和水中的校准品稀释液在六个不同浓度水平下的回收率，并比较回归线的斜率来确定回收率。通过测定白蛋白中低浓度和高浓度水平的对照样品的提取效率进行评估，这些对照样品通过在沉淀后添加分析物和IS来制备，以及通过将分析物在沉淀前添加到基质中、但IS在沉淀后添加来制备的白蛋白对照样品。
统计学
所有统计分析均使用内部Python脚本或GraphPad Prism 10.0进行。计算中使用的公式可在补充文件1中找到。
结果
色谱方法在10分钟的运行时间内成功分离了Kyn、Tyr、Phe、Trp和内标NT。Kyn和NT在360 nm波长下通过UV检测，而Tyr、Phe和Trp则通过荧光检测进行定量，Tyr和Phe的激发/发射波长为210/302 nm，Trp为286/366 nm。流动相由15 mM KH2PO4组成，以等度模式运行，流速设定为1.1 mL/min。该方法在三种不同基质中进行了测试：7%（w/v）白蛋白溶液（作为匹配人血清和血浆总蛋白含量的简单替代基质），以及炭吸附血浆（CDP）和炭吸附血清（CDS），以确保广泛的适用性。
该方法获得了分离良好、峰形对称的色谱峰，在白蛋白中的平均保留时间为：Kyn 3.1分钟，内标NT 6.2分钟，Tyr 1.5分钟，Phe 3.2分钟，Trp 7.9分钟；在CDS和CDP中Trp为7.8分钟（图2，表2）。
图2. 使用开发的方法参数在白蛋白基质中获得的标准混合物（Kyn = 15 μM, Tyr/Phe/Trp = 150 μM, NT(IS) = 25 μM）的色谱图。（A）在λ = 360 nm处Kyn和NT的UV检测。（B）Tyr和Phe在λ ex/em = 210/302 nm（0–5分钟；放大图）以及Trp在λ ex/em = 286/366 nm（5–10分钟）处的荧光检测。
该方法根据德国毒理和法医化学学会（GTFCH）的指南成功验证了选择性、线性、日内精密度、时间差异中间精密度、在白蛋白溶液或健康供体炭吸附血浆/血清中的准确度，以及在白蛋白基质中的回收率和稳定性。AA是内源性分析物。通过炭吸附获得了分析物减少的血浆和血清基质。然而，除了所有测量外，还测量了所有基质的空白样，并且在确定LOD和LLOQ值时，对各自峰范围内的空白基质进行了基线扣除。
方法的选择性，即在没有其他化合物干扰的情况下检测和识别目标化合物的能力，通过空白基质在与分析物相同保留时间处没有来自内源性化合物或降解产物的干扰信号得到确认。
使用水标准品测试了校准，并与白蛋白、CDP和CDS基质标准品进行了比较，发现是等效的。因此，随后使用白蛋白、CDP和CDS基质分析相应的QC样品，并使用白蛋白分析真实血清样品。通过绘制峰面积比（分析物/IS）对浓度来生成校准曲线。所有分析物在校准范围内均获得线性校准（R2> 0.99 / n = 8）：在白蛋白中，Kyn为0.31–20 μM，Phe为1.56–200 μM，Trp为0.08–200 μM，Tyr为0.78–200 μM；在CDP中，Kyn为0.63–20 μM，Phe为1.56–200 μM，Trp为0.78–200 μM，Tyr为0.78–200 μM；在CDS中，Kyn为0.31–20 μM，Phe为6.25–200 μM，Trp为6.25–200 μM，Tyr为1.56–200 μM。校准范围、线性方程、决定系数（R2）、LOD和LLOQ总结在表2中。使用信噪比评估LOD和LLOQ值，除Phe外，所有分析物的LLOQ均低于0.8 μM（Phe在白蛋白和CDP中的LLOQ为1.56 μM，在CDP中为6.25 μM），除Trp和Tyr外（Trp在CDS中的LLOQ为6.25 μM，Tyr为1.56 μM）。这些数据与文献数据一致。
获得了每种分析物在所有基质中的方法精密度和准确度。表3总结了精密度数据的结果，包括日间精密度和时间差异中间精密度、偏差、偏差和精密度的接受区间（95% β-容忍区间），以及在白蛋白中的回收率和提取效率。较低的RSDr和RSD(T)值表明一组测量值内的重复性和精密度较高。所有分析物的RSDr和RSD(T)均未超过10%（根据指南，≥ 15%被视为可接受）。方法的真实度水平以偏差百分比表示，所有分析物在所有基质中的偏差均在±10.8%以内。只有CDS中Trp的低QC值超过了15%（16.3%），但仍保持在指南规定的LOD的20%的可接受限度内。除了偏差和精密度外，还确定了95% β-容忍区间，除CDP中Kyn的低QC值（32.85%）外，所有分析物均在±30%的接受区间内，但仍保持在LOD的扩展限度±40%之内。为评估所提出方法的分析回收率，将白蛋白校准与100%的水校准进行比较。计算值在98%至100%之间。对于提取效率，测量了两种不同浓度（低浓度：Kyn为2 μM，Phe、Trp、Tyr为20 μM；高浓度：Kyn为20 μM，Phe、Trp、Tyr为200 μM）的对照样品，所有获得的提取物与对照样品的比率仅在93%至104%之间变化。
表3. 白蛋白、炭吸附血浆（CDP）和炭吸附血清（CDS）中的验证结果总结，包括重复性（RSDr）和时间差异中间精密度（RSD(T)）、偏差、95% β-容忍区间、回收率（R）和提取效率（EE）
（结果针对两个质控水平（QC低和QC高）显示：上行对应QC低，下行对应QC高。提取效率针对白蛋白在Kyn为2 μM（对照低）和20 μM（对照高），Phe、Trp、Tyr在20 μM（对照低）和200 μM（对照高）时测定。）
通过处理后样品稳定性和冻融稳定性获得了分析物在白蛋白空白基质中的稳定性。处理后样品在自动进样器中的稳定性在至少10小时后进行评估，这相当于常规分析批次的时间。证明所有分析物都是稳定的，因为在不同进样时间之间的回归中没有观察到显著的负趋势，并且峰面积的下降没有超过15%。
经过3个循环的冻融稳定性显示，低浓度和高浓度对照样品的平均结果在相应对照样品的100%至103%范围内，这证明了所有分析物的冻融稳定性。
为了评估实验室内分析的精密度以及方法的再现性，在同一实验室但在不同仪器上、由不同操作员制备的QC样品，以及在不同实验室使用不同设备测量的QC样品进行了测量。尽管本工作使用的实验设计无法计算再现性，但表4比较了在不同仪器上、由不同操作员制备并在不同实验室测量的QC样品中测得的分析物浓度，图3显示了43名供者血清样本组的相关性。所有值与对照测量值（仪器1）相比，差异均在±15%以内。此外，使用相同方法在两个不同实验室测量了健康供者的真实样本。
表4. QC样品中测得的分析物浓度（单位μM）比较
（QC低浓度代表Kyn为1.5 μM，Trp、Tyr、Phe为15 μM；QC高浓度代表Kyn为15 μM，Trp、Tyr、Phe为150 μM。由不同操作员制备的样品在仪器2上测量。所有样品均重复测量两次；在仪器1上测得的浓度是三次独立测量的平均值。）
图3. 在参考实验室（仪器1）和外部实验室（外部实验室1）使用基于RP18的HPLC方法和UV/FLD检测测量的43份血清样本中AA浓度Trp (A)、Kyn (B)、Tyr (C) 和Phe (D) 的比较（n = 43）。Pearson相关系数（r）表明存在强正
