新型鸭正呼肠孤病毒通过劫持巨噬细胞铁代谢诱导铁死亡机制研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Novel Duck Orthoreovirus Induces Ferroptosis in HD11 Cells by Hijacking Cellular Iron Metabolism and Promoting Iron Accumulation

本文首次揭示新型鸭正呼肠孤病毒（NDRV）通过上调转铁蛋白受体1（TfR1）促进铁离子（Fe2+）积累，诱导HD11巨噬细胞发生铁死亡（ferroptosis）。该研究从铁代谢紊乱新视角阐释了NDRV致脾脏坏死的分子机制，为靶向铁死亡的抗病毒策略提供了理论依据。

　　

3.1. HD11细胞NDRV感染模型的建立

由于鸭原代巨噬细胞体外培养周期短、转染效率低，本研究选用禽病原体感染研究中广泛应用的HD11细胞系建立体外NDRV感染模型。通过间接免疫荧光 assay（IFA）和qPCR检测病毒复制情况，结果显示NDRV感染可诱导LMH细胞产生典型的细胞病变效应（CPE），包括细胞皱缩、聚集成团及最终脱落悬浮。在HD11细胞中，当感染复数（MOI）设为1和5时，感染后24小时和48小时可观察到明显的CPE，主要表现为细胞皱缩和脱落。qPCR分析显示NDRV σA基因mRNA水平随时间推移逐步增加。IFA在感染HD11细胞中检测到特异性荧光信号，表明病毒活跃复制。这些结果共同证明NDRV能在HD11细胞中稳定复制，建立的体外模型适用于后续实验研究。

3.2. NDRV诱导HD11细胞铁死亡

为探究NDRV是否在体外诱导HD11细胞铁死亡，研究人员检测了感染后细胞形态及相关生物学反应。透射电镜观察显示线粒体出现铁死亡特征性改变，包括嵴断裂和嵴密度降低。Western blot和qPCR分析进一步证实铁死亡相关标志物PTGS2和GPx4在转录和蛋白水平均发生显著变化。使用DCFH-DA荧光探针评估细胞内ROS水平，发现感染后24小时ROS积累增加，48小时显著升高，而对照组未见明显变化。通过ImageJ软件对荧光面积比进行定量分析，表明ROS积累具有剂量和时间依赖性。这些发现表明NDRV在体外条件下能有效诱导HD11细胞铁死亡。

3.3. NDRV感染促进HD11细胞内Fe²⁺积累

巨噬细胞在铁代谢稳态中起关键作用。生理条件下，细胞将铁储存于铁蛋白中，通过铁转运蛋白（Fpn）输出或用于生物合成途径。然而细胞内不稳定铁离子（特别是Fe²⁺）的积累可催化Fenton反应，导致ROS过量产生，进而引起显著脂质过氧化并最终触发铁死亡。本研究使用FerroOrange荧光探针监测HD11细胞内Fe²⁺水平变化，结果显示感染后12小时HD11细胞内Fe²⁺含量显著增加，24小时积累更为明显，且积累程度与病毒剂量和感染时间呈正相关。

3.4. NDRV通过促进Fe²⁺积累诱导HD11细胞铁死亡

为探究Fe²⁺积累在NDRV诱导巨噬细胞铁死亡中的作用，研究人员用铁螯合剂去铁胺（DFO）预处理HD11细胞以降低细胞内铁水平和铁死亡敏感性。DFO单独处理对HD11细胞活力无显著影响，表明该浓度下无细胞毒性，适用于后续实验。在NDRV感染模型中，DFO预处理显著缓解了病毒诱导的细胞活力降低，提示其对病毒CPE具有保护作用。对铁死亡相关生化标志物的进一步分析显示，DFO显著降低了NDRV感染HD11细胞中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的积累，并有效抑制了ROS水平的升高。这些结果表明DFO通过铁螯合作用减轻NDRV诱导的氧化应激和脂质过氧化，从而抑制铁死亡。综上证明Fe²⁺积累是触发NDRV感染HD11细胞铁死亡的关键机制。

3.5. NDRV通过上调TfR1表达触发HD11细胞铁死亡

NDRV感染上调铁代谢相关基因（如TF、TfR1、Hmox1、ACO1和STEAP3）并下调铁输出基因Fpn。作为介导细胞铁摄取的关键膜受体，TfR1在铁死亡中起重要调控作用。本研究结果显示NDRV感染显著增强HD11细胞中TfR1在mRNA和蛋白水平的表达。为深入探讨TfR1在病毒诱导铁死亡中的功能作用，研究人员采用RNA干扰技术敲低TfR1表达，显著降低了NDRV诱导的细胞内Fe²⁺浓度增加，表明TfR1介导的铁摄取是NDRV感染过程中铁积累的核心机制。此外，病毒感染导致细胞内ROS水平显著升高，而沉默TfR1有效减弱了ROS积累，进一步支持TfR1参与NDRV诱导的氧化应激。这些发现共同表明TfR1在NDRV感染过程中上调，并通过促进铁内流和ROS产生促使巨噬细胞铁死亡，因此TfR1是NDRV诱导铁死亡的关键分子介质。

4. 讨论

病毒与宿主细胞间的复杂相互作用在病毒致病性和宿主免疫应答中至关重要。本研究首次提供直接证据表明NDRV触发巨噬细胞铁死亡，且NDRV通过劫持细胞铁代谢促进细胞内铁积累，从而诱导HD11细胞铁死亡，其中TfR1被确定为该过程的关键调控因子。这些发现揭示了NDRV通过破坏铁稳态导致宿主细胞损伤的分子机制，为阐明NDRV诱导鸭脾脏坏死的发病机制提供了重要理论基础。

NDRV感染引起鸭严重脾脏坏死，导致免疫抑制、继发感染易感性增加和疫苗失效。ARV具有巨噬细胞趋向性，脾巨噬细胞被确定为NDRV的主要靶细胞。本研究证实NDRV通过劫持铁代谢和促进细胞内铁积累诱导HD11细胞铁死亡。此外，NDRV σA蛋白抑制STAT1和STAT2核转位，从而干扰干扰素（IFN）信号通路。尽管NDRV感染在宿主细胞中触发IFN产生，但对IFN-I介导的抗病毒应答表现出显著抑制作用。

铁死亡作为一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，广泛参与多种疾病的病理生理过程。大量研究表明畜禽病原体可诱导铁死亡并加剧疾病严重程度。巨噬细胞是全身铁代谢的关键组成部分。铁积累可诱导巨噬细胞铁死亡，Fer-1处理能减轻相关肝损伤。除铁积累加剧RA中巨噬细胞铁死亡和组织损伤外，动脉粥样硬化应激损伤研究表明巨噬细胞P2Y12受体通过NF-κB/Hepcidin轴调节铁代谢，促进坏死斑块形成。铁死亡也是结核分枝杆菌感染期间组织坏死的主要机制。相反，巨噬细胞可通过调节铁死亡抵抗病原体。感染早期，巨噬细胞通过快速升高的Fe²⁺和脂质过氧化触发类铁死亡细菌杀伤作用。为巨噬细胞补充Fe²⁺或铁基纳米材料可抑制沙门氏菌和金黄色葡萄球菌感染并减少组织损伤。

靶向铁死亡是畜禽疾病防控的有前景策略。一方面，诱导铁死亡可抑制病原体复制。Erastin通过上调Nrf2、ACSL4和GPx4表达显著抑制Vero细胞中PEDV复制。另一方面，抑制宿主细胞铁死亡可减轻感染期间的组织损伤。铁积累作为抵抗草鱼呼肠孤病毒感染的一种防御机制。GCRV通过增加LIP诱导氧化应激来抑制病毒复制并提高细胞存活率。FAC给药显著降低病毒载量并改善细胞活力，表明铁补充可能作为病毒感染治疗的潜在辅助疗法。

TfR1是介导细胞铁摄取的关键受体，其上调增强细胞对铁死亡的易感性。积累证据强调TfR1在调节铁死亡中的关键作用。HBV通过靶向TfR1抑制铁流入，从而调节宿主细胞铁死亡。在D-半乳糖诱导的衰老大鼠中，铁调节蛋白2表达增加上调TfR1，促进Fe²⁺内流并诱导听觉皮层神经元铁死亡。在糖尿病心肌病中，Kat2a通过增强TfR1和Hmox1启动子区域的组蛋白乙酰化触发铁死亡。本研究首次表明NDRV感染上调HD11细胞中TfR1，导致铁积累和铁死亡，为深入研究NDRV蛋白与TfR1之间的分子相互作用奠定了基础。

总之，本研究首次证明NDRV通过破坏铁代谢和促进细胞内铁积累诱导HD11细胞铁死亡，为理解NDRV感染机制提供了重要实验基础。然而，NDRV调节铁稳态和铁死亡的具体信号通路、NDRV蛋白与宿主铁调节分子间的直接相互作用，以及铁死亡在体内病毒致病性中的实际贡献仍不完全清楚。需要进一步研究以全面阐明这些机制，这不仅将增强我们对NDRV发病机制的理解，还可能为NDRV及相关病毒感染的防控提供新见解和潜在治疗靶点。