《Nanoscale》：Liposome purification from micromolar protein background using diffusiophoretic trapping
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本文介绍了一种利用扩散泳（diffusiophoresis）和扩散渗透（diffiffusioosmosis）原理在开放式纳米通道中实现脂质体纯化的创新方法。研究通过Pluronic F-127涂层有效抑制蛋白质（如BSA、HSA）和胶体吸附，并维持通道壁zeta电位（约-11 mV），从而在微摩尔浓度蛋白质背景下成功捕获并纯化脂质体。该技术为液体活检中细胞外囊泡（EVs）的高效分离提供了新策略，推动其在早期疾病诊断中的应用。
引言
液体活检样本中含有蛋白质和胶体，例如细胞外囊泡（EVs）。EVs是由所有细胞类型分泌的脂质基颗粒，其膜组成与来源细胞相同。较小的细胞外囊泡（如外泌体）直径在30–120 nm之间，血浆中浓度约为0.9–13.4 × 108颗粒/mL。通过内吞作用，细胞质膜及其外部环境中的重要成分被内化，因此EVs携带有关来源细胞的重要信息。这促进了近年来从血液等液体活检中纯化EVs以用于诊断的多种方法的开发。
虽然蛋白质和较大颗粒（如细胞和细胞碎片）可通过离心和过滤有效去除，但尺寸和密度与EVs相似的胶体颗粒在EV纯化中更具挑战性。例如，脂蛋白（携带脂质和蛋白质的复杂颗粒）与较小EVs处于相同尺寸范围。密度梯度超速离心可用于EV纯化，但耗时且产率低，易导致EVs聚集，这不利于后续表征（如尺寸和密度测定）。这些局限性促使了基于微流控的替代纯化方法的发展，旨在以最小处理量直接从原始样本中纯化。
在微流控中，胶体通过场流分离从连续样本流中纯化。由于EVs带负电，若施加外电场，可通过电泳结合尺寸分离进行纯化。为避免外场需求，带电粒子在电解质浓度梯度中的自发迁移（即扩散泳）引起关注。扩散泳取决于粒子的尺寸和zeta电位，因此可用于在特定尺寸范围内按zeta电位分离胶体。扩散泳通常与其对应现象扩散渗透（由化学梯度诱导的液体输运）共同发生。扩散泳和扩散渗透的组合已应用于多种几何结构中的胶体分离，包括封闭通道、死端通道、带微槽的Ψ连接、H连接、T连接以及多个非共线梯度。特别地，Ψ连接流通装置实现了基于表面化学的胶体连续分离。
在先前工作中，我们利用开放式通道中扩散泳和扩散渗透的联合作用，从稀溶液中积累脂质体和外泌体。在该装置中，盐梯度施加于开放式通道上，引发扩散渗透流，其有效速度为uos。斯托克斯拖曳使粒子沿流动方向移动。由于扩散泳，带负电的脂质体以速度uph逆盐梯度移动。扩散渗透流抵消粒子扩散泳，导致捕集。在捕集位置x0，粒子净速度为零并积累。
通道内表面的zeta电位是捕集的关键因素，它驱动渗透流并防止粒子粘附。对于简单胶体样本（如仅含缓冲液中囊泡的溶液），具有高负zeta电位（-20至-30 mV）的磷脂涂层可驱动足够强的扩散渗透流以支持捕集和有效脂质体排斥。这已成功用于浓缩稀释在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的脂质体和外泌体。然而，血液成分（如蛋白质）处于微摩尔浓度，且EVs具有复杂表面组成。因此，将扩散渗透捕集应用于液体活检要求通道涂层有效抑制蛋白质和胶体吸附，同时具有支持扩散渗透的zeta电位。
Pluronic是生物相容性两亲性三嵌段聚合物家族，具有疏水聚环氧丙烷（PPO）嵌段和两个亲水聚环氧乙烷（PEO）链。Pluronic分子根据亲水-亲脂比和PEO链长度分类。Pluronic在金表面呈现刷状构象，由于亲水PEO链向溶液延伸，减少蛋白质吸附。针对牛血清白蛋白（BSA）的研究显示，Pluronic F-68降低疏水不锈钢上的蛋白质吸附，Pluronic L-35、P-123、F-108降低硅片上的蛋白质吸附。
Pluronic F-127因其抗蛋白质特性及在溶液中形成胶束的能力而广泛应用。因此，尽管Pluronic F-127是实现能处理微摩尔蛋白质浓度的扩散泳和扩散渗透捕集的有吸引力的表面钝化方法，但其弱zeta电位可能对扩散泳捕集构成挑战，因为诱导的扩散渗透流可能过弱无法抵消粒子扩散泳。
本文证明Pluronic F-127不仅实现表面钝化，还支持捕集。我们首先测量涂覆Pluronic的环烯烃共聚物（COC）装置表面的zeta电位。随后确认带-20至-30 mV zeta电位荧光标记脂质体在宽盐梯度范围内良好捕集于纳米通道中。Pluronic涂层有效防止粘附，即使对于高生物素化脂质体（通常强烈粘附于磷脂涂层表面）。最后，我们证明微摩尔背景蛋白质如何影响涂层zeta电位，并找到在微摩尔蛋白质背景下脂质体可靠积累的实验条件。随后，蛋白质通过扩散从纳米通道有效去除，纯化脂质体在纳米通道中上浓缩，增强荧光信号。我们还展示如何使用反向蛋白质梯度抵消血浆蛋白质对扩散渗透流的贡献，防止脂质体逃逸纳米通道，最大化检测荧光信号。
Pluronic涂层用于扩散泳和扩散渗透捕集
捕集通过在开放式纳米流体通道上施加恒定盐梯度实现。纳米流体通道通过COC注塑成型制造为一次性纳米流体装置。最终装置为圆盘（直径50 mm），带四个储液池（两个入口，两个出口），形状为LUER连接器，允许溶液加载和连接至压力控制单元。每个入口和出口之间运行微通道（宽50 μm，深5 μm）。微通道通过阵列漏斗形纳米通道连接，窄端和宽端分别为5 μm和20 μm宽。流体通道用COC箔（厚175 μm）通过UV辅助热压键合密封。本研究使用两种装置设计：L = 440 μm（设计1，与参考文献18相同）和L = 250 μm（设计2，见方法部分）。
制备装置用于扩散泳捕集的关键步骤是微通道和纳米通道的表面钝化。使用1% w/v合成聚合物Pluronic F-127水溶液钝化表面。我们首先检查Pluronic表面钝化是否导致足够强度的负渗透流以平衡扩散泳并成功捕集脂质体。为此，我们在纳米通道两端使用低（CL）和高（CH）盐浓度施加强盐梯度（ln(CL/CH) = -9.2），并引入带负电脂质体（zeta电位ζp= -30.1 ± 1.4 mV，直径d = 122.8 ± 0.6 nm）。通道内荧光带表明在Pluronic涂层装置（L = 440 μm）中成功实现扩散泳捕集。我们得出结论：表面带负电并诱导渗透流，抵消粒子扩散泳，导致粒子积累。粒子浓度分布C(x)（与荧光强度分布成正比）在x0处有最大值。在捕集位置，uph(x0) + uos(x0) = 0。C(x)的宽度主要由粒子布朗运动决定，尽管非均匀流速剖面导致的分散也可能贡献。
捕集发生在x0/L ～ 0.25，而使用高负电磷脂涂层时，相同脂质体和盐梯度下捕集发生在x0/L ～ 0.04。较大x0意味着Pluronic涂层的渗透流较弱，因此表面zeta电位ζch负性较低。
在参考文献18中，我们推导了粒子浓度C(x)的模型。简言之，该模型假设有效漂移速度取决于通道壁zeta电位ζch，且扩散泳速度与ln(CL/CH)成比例。当ζch通过流动校准已知时，C(x)取决于粒子尺寸和zeta电位。此简化模型忽略若干效应，如通道流速剖面导致的可能分散、DP速度与绝对盐浓度的缩放以及PBS溶液中除氯化钠外其他电解质的存在（这些可在参考文献11中考虑）。尽管有这些局限性，该模型描述了尺寸范围[70;160] nm、zeta电位范围-[25;50] mV的脂质体捕集实验。此处，我们改为拟合通道壁zeta电位ζch，使用动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）测量的粒子直径和zeta电位值（直径d = 122.8 ± 0.2 nm，zeta电位ζp= -30 ± 1.4 mV）。
Pluronic涂层在COC上的壁zeta电位拟合值为ζch= -11.10 ± 0.02 mV，与四个相邻纳米通道平均值-11.17 ± 0.05 mV一致（图S1），且与先前研究一致。在溶液中，负载姜黄素的Pluronic胶束显示弱zeta电位（Pluronic P-123为ζp= -7.37 mV，Pluronic F-127为ζp= -13.93 ± 1.07 mV）。此外，当Pluronic用作涂层时，它倾向于反映底层材料特性。例如，具有高负zeta电位的银纳米棱柱涂覆1.25% (w/v) Pluronic溶液后，因屏蔽效应呈现-10 mV zeta电位。
接下来，我们研究Pluronic涂层是否也抑制更复杂表面胶体的粘附。为此，我们重复实验使用生物素化脂质体。生物素化脂质体的扩散泳捕集在使用磷脂涂层时通常失败，因生物素部分疏水性易导致粘附（图S2）。相反，Pluronic涂层抑制粘附，生物素化脂质体成功捕集于x0/L ～ 0.2。使用ELS和DLS测量的脂质体zeta电位和尺寸（ζp= -29.8 ± 2.9 mV，d = 119 ± 1 nm）拟合浓度分布，得到通道zeta电位ζch= -11.80 ± 0.01 mV，与四个相邻纳米通道平均值-11.70 ± 0.21 mV一致（图S1f–j），且接近非生物素化脂质体值（ζch= -11.17 ± 0.05 mV，图S1e）。
BSA和HSA溶液中脂质体纯化
在证明Pluronic涂层支持扩散渗透和捕集后，我们研究蛋白质背景对脂质体捕集的影响，并证明蛋白质如何影响通道壁。此过程分三步进行。
首先，将L = 440 μm纳米通道装置（设计1）涂覆Pluronic (1% w/v)，在无蛋白质强盐梯度（ln(CL/CH) = -9.2）下捕集特征明确DiO标记脂质体。持续积累一分钟后，从微通道去除脂质体，固定量粒子被捕集。纳米通道荧光分布图（图2a蓝线）及以通道壁zeta电位为唯一拟合参数对C(x)的拟合显示ζch= -11.8 mV（图S3a）。
接下来，通过压力驱动流从纳米通道去除脂质体。新样本溶液含脂质体（20.7 nM颗粒）和BSA（2 μM）从低盐度微通道引入，使用相同盐梯度（-9.2）。
通道荧光信号线性增加表明脂质体持续积累。这在无蛋白质且微通道中存在恒定粒子浓度时也观察到（图2b）。捕集位置x0初始随时间增加（图2c），粒子分布变宽（图2d），因捕集位置进一步移入纳米通道。
最后，我们评估蛋白质背景是否能有效从捕集器中去除，以及BSA是否不可逆改变通道壁zeta电位。为此，通过施加压力将含脂质体的BSA溶液从纳米通道冲洗出。新无BSA脂质体溶液以相同盐梯度（-9.2）引入微通道。脂质体捕集位置与装置暴露于BSA前获得的捕集位置相似（图2a黄线）。新荧光强度分布拟合显示ζch与引入BSA前测量的ζch相比约1 mV差异（图S3b）。这表明BSA在纳米通道壁上的吸附效应（如果存在）极小且可逆。我们还注意到，荧光带积分强度与捕集器中粒子总数成正比，且不同实验时间的强度分布可比，因它们均以相同照明和曝光时间记录。因此，导致较小x0/L捕集的条件在恒定捕集粒子数下产生更窄分布和更高峰值强度。
在图2c中，捕集位置初始变化可能源于纳米通道中蛋白质梯度建立，这可能影响渗透流率和粒子扩散泳速度，因中性电解质溶液已显示诱导扩散渗透。低盐度微通道中2 μM BSA溶液扩散入纳米通道，梯度在特征时间尺度τ = L2/D ～ 56分钟建立，基于白蛋白扩散系数D = 58 μm2s-1。此特征时间尺度假设纳米通道无对流，但本实验因存在反向渗透流体流而不成立。因此，我们预期梯度建立慢于特征时间尺度，但梯度建立特征时间尺度相对于实验持续时间足够短，可合理假设25分钟后蛋白质梯度稳定。假设两个微通道间线性蛋白质浓度梯度，捕集位置蛋白质浓度估计为微通道蛋白质浓度的75%，即1.5 μM。此结果基于假设纳米通道位置x处蛋白质浓度C(x) = C0(1 - x/L)，且对于x0? L/4和C0为引入微通道蛋白质浓度，C(x0) = 0.75 × C0。
BSA在研究中用作血液中人血清白蛋白（HSA）模型。BSA和HSA是同源蛋白质，但结构差异（如HSA中α螺旋比例更高）使HSA比BSA更疏水。我们重复实验使用8 μM HSA。首先，使用强盐梯度（-9.2）引入含脂质体和HSA溶液。脂质体初始积累在捕集器x0/L ～ 0.25（图2e，‘1 min’曲线）。随后30分钟，捕集器荧光信号线性增加，表明粒子稳定积累（图2f）。捕集位置x0进一步移入通道，分布全宽半高（FWHM）增加，与2 μM BSA观察相似（图2a）。两值达到稳态水平（图2g和h）。接下来，微通道中样本溶液更换为清洁低盐缓冲液。脂质体保持捕集，但捕集位置移向纳米通道入口，表明HSA通过扩散从纳米通道去除（图2e黄线）。最后，脂质体捕集于x0/L ～ 0.2。HSA去除后脂质体荧光强度分布拟合（图S4）得到与无蛋白质时相同的通道壁zeta电位，证实微摩尔范围HSA从胶体样本中成功去除。
血浆中脂质体纯化
通过扩散泳捕集从血浆纯化EVs面临若干挑战。首先，EVs相对于蛋白质丰度较低是主要挑战。健康人血浆中外泌体浓度为108至1010颗粒/mL，而HSA浓度高七个数量级（35–50 g L-1，即1017颗粒/mL范围）。我们通过Pluronic涂层优异抗粘附特性解决此问题。
然而，血浆离子强度也是扩散泳捕集关注点。人血浆离子强度与1× PBS缓冲溶液相似。为对抗高盐溶液（10× PBS）产生足够盐梯度，我们必须稀释样本，这也意味着稀释EV浓度。渗透流率和渗透流速度与纳米通道长度成比例，vos～ ln(CL/CH)/L。为最小化样本稀释，我们使用较短捕集器。此处注意，因漏斗形纳米通道，梯度越高，检测荧光信号越高。因此，为最小化样本稀释，我们使用装置设计2（L = 250 μm），对于相同样本稀释（1:10），产生约两倍于设计1的扩散泳强度。
在以下实验中，我们首先在无蛋白质下捕集荧光脂质体（POPC:POPG 3:1，d = 123 nm，ζp= -30 mV）悬浮于10-3× PBS溶液（图3a，‘脂质体’）。对于强盐梯度（ln(CL/CH) = -9.2），捕集位置在x0/L ～ 0.25（图3b虚线）。保持脂质体在捕集器中，引入稀释血浆（1:10）到低盐微通道，改变盐梯度值至ln(CL/CH) = -4.6。如预期，脂质体捕集位置进一步移入纳米通道，被捕集粒子分布变宽（图3a，‘血浆中脂质体’，图3b实线）。最后，将无蛋白质10-3× PBS溶液引入微通道，脂质体从纳米通道去除，显示纳米通道壁无粒子粘附（图3a，‘冲洗’，图3b虚线）。这突出表明Pluronic涂层在高蛋白质浓度（～100 μM对应10%血浆）下防止蛋白质和脂质体与非特异性相互作用。
在血浆初始实验（图3）中，血浆存在下捕集位置远在纳米通道内部。在进一步研究前，我们确认两种设计中脂质体捕集相似。为此，我们捕集脂质体并测量每种装置设计五个独立实验壁zeta电位，得到设计1 ζch= -11.5 ± 0.1 mV，设计2 ζch= -10.24 ± 0.09 mV，表明设计特定偏移（图S5）。我们将此偏移归因于设计特定残余流，即微通道中压力驱动流在纳米通道中诱导的流。残余流率可通过渗透流率校准确定。对于L = 440 μm芯片（设计1），所得残余流率为-28 fL min-1（图S6），与相同装置先前测量良好一致。相反，我们预期残余流在较短纳米通道设计（L = 250 μm）中作用更大，因其流体阻力较低。然而，对于相等盐梯度，较短纳米通道因较低流体阻力也应产生较大扩散渗透流。我们得出结论：尽管较短纳米通道装置设计2残余流强于设计1，但与渗透流相比仍可忽略，并导致相似捕集。这通过设计2中1 μM BSA存在下脂质体捕集结果与设计1匹配证实（图S7）。
因此，我们得出结论：观察到的捕集位置变化主因是血浆引入诱导的强蛋白质梯度。我们怀疑这导致整体扩散渗透和扩散泳的额外贡献，引起捕集位置偏移。这对粒子捕集是明确缺点，因当粒子分布与通道末端x = L重叠时粒子可能逃逸。为最小化此现象，我们通过在髙盐度微通道添加100 μM BSA平衡低盐度微通道稀释血浆（1:10稀释）诱导的蛋白质梯度。我们首先在无蛋白质强梯度（ln(CL/CH) = -9.2）下捕集脂质体（图4a）。荧光强度分布显示捕集位置x0/L ～ 0.25（图4b）。接下来，从10%血浆溶液捕集相同脂质体，同时BSA添加到髙盐度通道。积累15和30分钟后荧光图像（图4a）显示捕集位置偏移，但接近x0/L ～ 0.25（图4c和d）。使用稀释血浆时盐梯度强度降低（ln(CL/CH) = -4.6）主要解释捕集位置偏移。因此，蛋白质梯度诱导的渗透流贡献可大部分被平衡。因此，被捕集脂质体不逃逸，提高捕集效率。最后，作为实验最后一步，将无蛋白质溶液引入微通道（图4a和e），允许蛋白质从纳米通道扩散出。此阶段，所用盐浓度导致强盐梯度（ln(CL/CH) = -9.2），因此捕集位置移近纳米通道窄端。脂质体不仅从蛋白质纯化，还通过纳米通道漏斗形状和扩散泳作用联合效应进一步浓缩。由于纳米通道宽度减小且粒子分布在x0/L → 0时更窄，当x0/L最小化时，积累脂质体荧光信号最大化（图4e）。引入血浆样本前和去除蛋白质后脂质体分布拟合显示成功从蛋白质纯化，同时通道zeta电位保持不变（图S8）。
最后，我们注意实验中粒子经历的最大离子强度为x0/L ～ 0.5处，梯度对应ln(CL/CH) = -4.6。此处我们估计离子强度为5× PBS，近似盐浓度线性函数。脂质体在此高离子强度下稳定性可能受关注。然而，在实验此阶段，脂质体处于血清蛋白质存在下。血清蛋白质（如白蛋白）形成蛋白质冠
