《Nanoscale Horizons》：Simultaneous detection of lymphocytes and tumor cells in vivo in response to STING-TLR9 immunotherapy with Raman active multiplexed gold nanostars
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本文开发了多重金纳米星（MGNs）探针，结合表面增强拉曼光谱（SERS）技术，实现了对免疫冷肿瘤（4T1小鼠乳腺癌模型）中CD8+T细胞与VEGFR2+肿瘤细胞的实时、多重、空间分辨动态监测。研究通过靶向STING（干扰素基因刺激因子）与TLR9（Toll样受体9）联合免疫疗法，首次在活体内同步追踪治疗响应中免疫细胞浸润与血管生成标志物的变化，并成功区分治疗应答与非应答群体。该技术突破了传统影像学（如MRI、PET）无法多重检测的局限，为精准免疫疗效评估提供了新策略。
引言
动态实时分子成像技术能够揭示肿瘤微环境（TME）中关键标志物的变化，但传统影像学与组织病理学难以捕捉治疗过程中细胞类型的动态异质性。本研究基于表面增强拉曼光谱（SERS）与多重金纳米星（MGNs）探针，实现了对免疫治疗响应中CD8+T细胞与VEGFR2+肿瘤细胞的双重追踪。STING与TLR9激动剂的联合应用可激活I型干扰素（IFN-1）应答，增强肿瘤免疫原性，但其动态调控机制仍需高分辨率成像技术解析。
结果与讨论
MGNs通过共价连接抗CD8与抗VEGFR2抗体及拉曼报告分子（pMBA与DTNB），形成特异性探针（图1）。表征显示其粒径约65 nm，表面电荷近中性，血清稳定性良好（图1g-h），且对4T1细胞无显著毒性（图1i）。剂量实验表明低剂量MGNs（0.6 mg/只）在活体成像中信号更强（图2b-d），且靶向组信号显著高于非特异性IgG对照组（图2e-g）。
在STING+TLR9治疗组中，活体SERS成像显示治疗后6小时即出现VEGFR2表达下降与CD8+T细胞浸润增加（图3h-i），与流式细胞术（FACS）结果一致（图3f）。ELISA与免疫荧光（IF）验证了治疗组中TNF-α、IFN-γ、IL-6等促炎因子上升（图4a-d），且CD31+血管密度与Ki67+增殖细胞减少（图4f-h）。相反，抗OX40治疗组未引起显著生物学变化（图5），SERS信号与对照组无差异，证实MGNs可区分治疗耐药。
离体SERS空间图谱进一步揭示了CD8+与VEGFR2+标志物在肿瘤组织中的分布异质性（图6c-d），其量化结果与IF标记呈中度至强相关性（图6i）。例如，rCD8与iCD8相关性达0.84，rVEGFR2与iVEGFR2达0.86，证实SERS与传统病理学结果高度一致。
结论
MGNs-SERS平台实现了活体水平的多重细胞动态监测，克服了临床影像技术的局限性。其空间分辨能力为肿瘤异质性研究提供了新工具，未来通过扩展拉曼报告分子库，有望构建更全面的TME分子图谱。
