CLDN5通过结合β1-整合素调控足细胞胞外基质粘附的新机制及其在肾小球损伤中的保护作用

《Journal of Biological Chemistry》：CLDN5 as a novel modulator of podocyte adhesion to extracellular matrix via β1-integrin binding

本研究聚焦于肾小球滤过屏障关键细胞——足细胞的粘附机制。研究人员发现紧密连接蛋白CLDN5在足细胞中发挥非经典功能，它通过与β1-整合素直接相互作用，抑制HUWE1介导的K774位点泛素化降解，从而稳定β1-整合素膜定位并增强足细胞-肾小球基底膜粘附。在高血压和ADR肾病模型中，CLDN5缺失导致足细胞损伤加剧，而血管紧张素转换酶抑制剂可逆转表型。该研究揭示了CLDN5在机械应力保护中的新功能，为肾小球疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在肾脏的精密过滤单元——肾小球中，高度分化的足细胞（podocyte）通过其独特的足突结构相互交错，形成一道至关重要的过滤屏障。这些细胞需要牢固地粘附在肾小球基底膜（GBM）上，以承受持续的血流动力学压力，确保尿液生成过程中精确的分子筛滤功能。然而，在多种慢性肾脏疾病（如局灶节段性肾小球硬化症FSGS）中，足细胞的粘附功能受损，导致细胞脱落和蛋白尿，最终进展至肾衰竭。尽管已知整合素（尤其是α₃β₁-整合素）是介导足细胞与GBM粘附的核心受体，但调控该过程的精细分子机制，特别是如何帮助足细胞抵御机械应力的机制，仍有大量未知。

传统上，claudin（CLDN）蛋白家族被视为构成细胞间紧密连接（tight junction）的主要成分，负责调控细胞旁路的离子和溶质通透性。然而，近年研究发现某些claudin成员在成熟足细胞（这类细胞缺乏典型的紧密连接结构）中仍有表达，并可能参与非经典功能。其中，CLDN5（claudin-5）在肾小球中的表达和功能尤其引人关注。先前研究发现CLDN5可通过转录调控WNT信号通路影响足细胞稳态，但该途径并不能完全解释CLDN5缺失导致的严重表型，提示其可能存在其他重要功能。

为了回答这些问题，来自山东大学齐鲁医院泌尿外科赵圣帝、宫永锋团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项研究，揭示了CLDN5作为足细胞粘附关键调控因子的全新角色。研究人员综合利用超分辨显微成像、分子生物学、生物化学及基因工程小鼠模型，首次发现CLDN5直接与β₁-整合素（β1-integrin）结合，并通过抑制E3泛素连接酶HUWE1介导的降解途径来稳定β₁-整合素蛋白水平，从而增强足细胞对抗机械应力的能力。

为开展此项研究，作者运用了多种关键技术：包括利用足细胞特异性条件性基因敲除（Cldn5-KO）小鼠模型；通过超分辨膨胀显微镜（expansion microscopy）进行蛋白共定位分析；采用免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）技术验证蛋白质相互作用；利用蛋白质稳定性测定（环己酰亚胺CHX追踪）和泛素化分析探索蛋白降解机制；构建嵌合体（chimeric）蛋白进行功能域定位；以及建立高血压（DOCA/高盐）和ADR肾病小鼠模型进行在体功能验证。实验所用小鼠原代足细胞通过免疫磁珠分选获得，人肾组织样本来源于FSGS患者活检及癌旁正常组织。

CLDN5定位于足细胞-GBM界面并增强足细胞粘附

通过高分辨率膨胀显微镜，研究者精确描绘了CLDN5在肾小球内的空间分布：它与β₁-整合素共同定位于足细胞与GBM的接触界面，并富集于粘着斑（focal adhesion）结构中。功能实验表明，敲除Cldn5显著损害了原代足细胞在各种细胞外基质（如纤维连接蛋白、胶原蛋白I/IV、层粘连蛋白-α₅β₂γ₁）上的粘附与铺展能力，且细胞对基质刚度变化的适应性也下降。

足细胞CLDN5缺失导致β₁-整合素表达和定位紊乱

机制探索发现，Cldn5缺失并不影响β₁-整合素的mRNA水平或活化状态，但显著降低了其总蛋白及膜表面蛋白量。脉冲追踪生物素化实验进一步揭示，CLDN5缺失促进了β₁-整合素的内化。在Cldn5-KO足细胞中回补β₁-整合素可部分挽救细胞粘附缺陷，表明CLDN5主要通过调控β₁-整合素稳定性来影响足细胞粘附。

CLDN5保护β₁-整合素免于HUWE1介导的泛素化降解

深入机制研究表明，CLDN5缺失导致β₁-整合素蛋白降解加速，且该过程可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断。免疫共沉淀-质谱分析鉴定出E3泛素连接酶HUWE1是结合β₁-整合素的关键分子。在Cldn5-KO足细胞中，HUWE1与β₁-整合素的相互作用增强，后者泛素化水平升高。点突变实验证实β₁-整合素胞内区K774是HUWE1介导泛素化的关键位点。

CLDN5通过其胞内环和C端结构域与β₁-整合素相互作用

通过构建CLDN5/CLDN4嵌合体并进行结构域映射，研究者发现CLDN5通过其胞内环（ICL）和C末端（C-term）直接结合β₁-整合素的胞内段。这种相互作用阻断了HUWE1对β₁-整合素的结合与泛素化，从而发挥稳定作用。表达含有CLDN5的ICL/C-term区域的CLDN4嵌合体可部分恢复Cldn5-KO足细胞的粘附功能。

CLDN5在体内增强足细胞粘附

在体实验证实，在高血压（DOCA/高盐）模型中，Cldn5-KO小鼠出现更严重的蛋白尿、肾小球硬化和足突消失。血管紧张素转换酶抑制剂依那普利治疗可缓解该表型。在ADR肾病模型中，原本耐受的C57BL/6背景的Cldn5-KO小鼠出现严重肾损伤，而易感的BALB/c小鼠本身基底CLDN5表达较低。人FSGS肾组织分析也显示CLDN5表达下降与病变严重程度相关。

本研究系统阐明了CLDN5在足细胞中扮演的非经典角色：它通过直接结合β₁-整合素，抑制其HUWE1介导的泛素化降解，从而稳定足细胞与GBM的粘附，帮助细胞抵御肾小球内机械应力。这一发现不仅拓展了我们对claudin蛋白家族功能多样性的认知，也为理解足细胞病机制提供了新视角。CLDN5-β₁-整合素轴可能成为未来防治蛋白尿性肾病的新靶标。