《Journal of Biological Chemistry》：F2,6BP restores mitochondrial genome integrity in Huntington’s Disease
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本研究针对亨廷顿病中线粒体DNA损伤修复障碍这一关键问题，揭示了糖酵解酶PFKFB3及其代谢产物F2,6BP在线粒体DNA修复中的新功能。研究人员发现F2,6BP是DNA末端加工酶PNKP的关键辅因子，其水平在HD患者脑中显著降低导致mtDNA断裂积累。补充F2,6BP可恢复PNKP活性、改善线粒体功能并减少mHTT聚集，为HD治疗提供了新靶点。
在大脑这个精密运作的指挥中心里，神经元细胞的健康维系着我们的思维、记忆和行动。然而，对于亨廷顿病（Huntington's Disease, HD）患者而言，一种名为突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin, mHTT）的异常蛋白质，如同一个潜伏的破坏者，正在悄然侵蚀着这些神经细胞的生存根基。亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，由HTT基因中CAG重复序列的异常扩展引起。尽管其病因明确，但导致脑细胞死亡的深层机制仍笼罩在迷雾之中。近年来，科学家们将目光投向了细胞能量的工厂——线粒体。越来越多的证据表明，线粒体功能受损是HD发生和发展的关键推手。线粒体拥有自己独立的基因组（mtDNA），它极易受到细胞内活性氧（ROS）的攻击而损伤。如果损伤的DNA得不到及时修复，线粒体的核心功能就会崩溃，最终导致细胞死亡。那么，在HD中，线粒体DNA的修复系统是否也出现了故障？这个故障又是如何导致神经元衰亡的呢？
为了解开这个谜团，由Tapas Hazra和Gourisankar Ghosh共同领导的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项开创性研究。他们发现，一种名为多核苷酸激酶3‘-磷酸酶（Polynucleotide kinase 3’-phosphatase, PNKP）的关键DNA修复酶，在HD患者脑部的线粒体中“罢工”了，但其蛋白数量并未减少。这背后隐藏的真相是：一个熟悉的“老朋友”——果糖-2,6-二磷酸（Fructose-2,6-bisphosphate, F2,6BP），竟然扮演着激活PNKP的关键角色。F2,6BP是糖酵解途径中著名的变构调节剂，由6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3（PFKFB3）催化生成。令人惊讶的是，研究团队发现PFKFB3和F2,6BP同样存在于线粒体中，并且是线粒体DNA修复复合物的一员。在HD的情况下，线粒体内的PFKFB3和F2,6BP水平显著降低，使得PNKP因缺乏辅因子而活性大减，导致mtDNA断裂持续积累，线粒体功能全面恶化。更为重要的是，从外部补充F2,6BP，能够成功恢复PNKP的活性，修复mtDNA损伤，部分改善线粒体功能，甚至减少致病蛋白聚集体的形成。这一发现不仅揭示了HD病理的新机制，更重要的是，指出了一个利用人体内源代谢物进行“由内而外”治疗的全新策略。
本研究的关键技术方法主要包括：使用来自密歇根脑库的亨廷顿病患者及年龄匹配对照者的死后额叶皮层组织样本进行线粒体提取；通过免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光技术分析蛋白表达、定位及相互作用；利用放射性底物法测定PNKP的3‘-磷酸酶活性；采用长片段扩增定量PCR（LA-qPCR）评估线粒体DNA链断裂积累；通过荧光滴定法测定F2,6BP与PNKP的结合亲和力；使用流式细胞术和Seahorse能量代谢分析系统分别评估线粒体膜电位和呼吸功能；并在HD果蝇模型中进行体内验证。
结果与讨论
线粒体PNKP活性在HD中降低
研究人员首先检测了HD患者死后额叶皮层线粒体提取物中PNKP的3‘-磷酸酶活性。与健康对照组相比，HD样本中的PNKP活性显著降低（图1A，泳道6-9 vs 2-5）。同时，HD患者脑组织中的线粒体活性氧（mtROS）水平显著更高（图1B）。通过长片段扩增qPCR（LA-qPCR）检测线粒体基因组完整性，发现HD大脑中线粒体DNA链断裂（SBs）显著积累（图1C，泳道5-8 vs 1-4）。这些结果表明，PNKP活性降低与mtDNA损伤积累和氧化应激增加同时发生，是HD病理的重要组成部分。
HD患者中PFKFB3和F2,6BP水平降低破坏了线粒体PNKP活性
为了探究PNKP活性降低的原因，研究人员检测了PFKFB3在线粒体中的存在。他们在HEK293细胞、野生型小鼠纹状体神经元（Q-7）细胞以及健康对照者脑组织的线粒体提取物中均检测到了PFKFB3（图2A-C）。免疫共沉淀实验证实，PFKFB3与PNKP、线粒体DNA聚合酶γ（POLG）和HTT存在于同一个线粒体DNA修复复合物中（图2D）。免疫荧光染色也显示PFKFB3定位于Q-7细胞的线粒体和细胞核（图2E）。重要的是，在HD小鼠纹状体神经元细胞（Q-111）和HD患者脑组织的线粒体提取物中，PFKFB3的水平显著降低，而PNKP的蛋白水平保持不变（图2B，C）。相应地，HD患者线粒体提取物中的F2,6BP水平也降低了约2.5倍（图2I）。这些数据表明，PNKP活性降低是由于其辅因子F2,6BP的减少，而非PNKP本身蛋白水平的下降。
HD中线粒体功能失调
研究人员进一步评估了线粒体的功能状态。使用TMRM染料通过流式细胞术分析发现，Q-111细胞的线粒体膜电位显著低于Q-7细胞（图3A-C）。使用MitoView?650染料对从健康对照和HD患者脑组织分离的纯化线粒体进行分析，显示HD样本中线粒体群体呈现异质性，而健康对照则为单一均匀群体（图3E-G），提示HD中线粒体健康状态不佳。Q-111细胞中的mtROS水平也显著更高（图3H）。通过Seahorse能量代谢分析仪检测细胞呼吸功能，发现Q-111细胞的耗氧率（OCR）、非线粒体耗氧、基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力均显著降低（图3I-M）。这些结果综合表明，HD中线粒体PFKFB3/F2,6BP水平的降低与线粒体功能严重受损密切相关。
外源性F2,6BP通过直接结合恢复线粒体PNKP活性
研究人员通过荧光滴定法证实了PNKP与F2,6BP的直接结合，其解离常数（Kd）为525 ± 25 nM，而结构相似的代谢物F1,6BP即使在更高浓度下也不与PNKP结合，显示了结合的特异性（图4A, B）。功能实验表明，在体外将F2,6BP添加到来自HD患者脑组织（图4C）或Q-111细胞（图4D）的线粒体提取物中，能以剂量依赖的方式恢复PNKP的3‘-磷酸酶活性，而F6P或F1,6BP则无此效果。在细胞水平，将F2,6BP导入Q-111细胞72或96小时后，其线粒体提取物中的PNKP活性（图5A）以及线粒体基因组完整性（图5B）均得到显著恢复。
外源性F2,6BP抑制致病性HTT聚集体的形成
F2,6BP处理还能部分恢复Q-111细胞的线粒体完整性和PFKFB3水平（图2G, H；图6A）。免疫共沉淀显示，Q-111细胞中PNKP与PFKFB3的结合减少，而F2,6BP处理可恢复这种结合（图6A）。伴随而来的是线粒体膜电位的提高（图3D）、mtROS水平的降低（图3H）以及线粒体呼吸功能的显著改善（图3I-M）。尤为重要的是，使用硫黄素T（ThT）染料和MW8抗体进行检测，发现F2,6BP处理能显著减少Q-111细胞中由扩展polyQ的HTT蛋白形成的致病性聚集体（图6B, C）。
补充F2,6BP恢复果蝇HD模型中的线粒体DNA完整性
在HD果蝇模型（神经元表达Htt128Q）中，补充F2,6BP能显著修复其线粒体基因组损伤，使基因组完整性恢复到与对照w1118果蝇相当的水平（图7）。这证实了F2,6BP在体内模型中修复线粒体DNA损伤的有效性。
研究结论与意义
本研究揭示了PFKFB3及其代谢产物F2,6BP在维持线粒体基因组完整性中的一个前所未有的重要功能。在HD病理条件下，线粒体内PFKFB3和F2,6BP水平的显著降低，导致其辅因子依赖的PNKP活性受损，进而引起mtDNA断裂积累、线粒体功能紊乱（包括膜电位下降、ROS增加、呼吸功能受损）以及mHTT致病聚集体形成。补充F2,6BP能够通过直接结合并激活PNKP，逆转上述病理过程。该研究的重要意义在于：首先，它将一种基本的代谢物F2,6BP与DNA修复和线粒体功能这两个在神经退行性疾病中至关重要的过程直接联系起来，深化了对HD发病机制的理解。其次，它提出了一个新颖的治疗理念，即利用人体内源性的小分子代谢物（F2,6BP）或其类似物，通过同时恢复细胞核和线粒体两个关键区室的基因组稳定性，来治疗HD这类目前无法治愈的疾病。这种“由内而外”的治疗策略，可能具有更好的安全性和有效性前景，为开发HD及其相关疾病的新疗法奠定了坚实的理论基础并指明了新的方向。
