双光子聚合微血管环境：用于血脑肿瘤屏障多细胞建模的创新平台

《Advanced Materials Technologies》：Two-Photon Polymerized Microvascular Environments for Multicellular Modeling of the Blood–Brain Tumor Barrier

本研究开发了一种基于双光子聚合（2PP）技术的新型3D微血管平台，用于体外模拟血脑肿瘤屏障（BBTB）。该平台通过制造具有微米级精度的多孔毛细管支架（μPC），支持人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）形成具有体内样极化和排列的管状单层。与2D培养相比，3D μPCs上的内皮细胞显示出更高的细胞骨架（微管蛋白、F-肌动蛋白）和屏障标记物（ZO-1、CD31）表达。该模型能响应TNF-α刺激，并支持与周细胞和胶质瘤细胞的共培养和三重培养。胶质瘤细胞的加入导致CD31表达降低和PLVAP表达升高，表明屏障稳定性被破坏。μPCs还可通过芯片内2PP技术集成到商用微流控芯片中，实现稳定灌注并提供对内皮腔内侧和腔外侧的访问。该仿生模型为研究内皮完整性、肿瘤-血管串扰以及屏障生物学研究的广泛应用提供了一个多功能平台。

　　

微血管平台的构建与表征

研究团队利用双光子聚合（2PP）这一高精度增材制造技术，成功制备了名为MicroPorous tube-like Capillary scaffold（μPC）的三维微血管支架。该支架的设计核心是模拟脑毛细血管的几何特征，其直径在40至50微米之间，接近体内BBB血管（平均直径7-9微米）和BBTB血管（平均直径15-30微米）的尺寸。μPCs长度为1毫米，由纵向和横向梁构成，梁厚度为3微米，支架壁上的梯形孔隙面积最大可达约270 μm²，允许培养基和细胞通过。制造材料选用生物相容性好且自发荧光低的IP-Visio光敏聚合物。这些结构最初在ITO（氧化铟锡）镀膜玻璃基板上制作，用于静态培养模型的研究。

扫描电子显微镜（SEM）图像证实了μPCs结构的高精度制造。免疫荧光（IF）成像显示，无论是HUVECs还是更贴近生理的hCMEC/D3细胞，均能在胶原包被的μPCs上实现均匀的定植和融合，形成连续的、管状的血管样结构。横截面视图表明，内皮细胞在μPCs上形成了薄层，其厚度与2D培养无显著差异，且未观察到多层细胞，证实了单层内皮的形成。

内皮细胞在μPCs上的组织与屏障完整性

在3D μPCs上培养的内皮细胞展现出更接近体内的细胞骨架组织和细胞核形态。β-微管蛋白和F-肌动蛋白的荧光强度在μPCs上比相邻2D区域高出约两倍，表明细胞骨架更加发达和有序。细胞核分析揭示，μPCs上的细胞核面积更小（99 ± 64 μm²），更接近体内值（78 μm²），并且核伸长率（纵横比2.24 ± 0.31）与体内报道值（2.23）高度一致。此外，细胞核沿μPCs纵轴排列，模仿了体内内皮细胞沿血管轴的天然排列方式，而在2D表面上核排列则更为随机。

屏障功能的关键蛋白表达在μPCs上也得到增强。紧密连接蛋白ZO-1和内皮细胞粘附分子CD31在μPCs上的表达显著高于2D培养，并且主要定位在细胞-细胞边界，表明形成了功能性的细胞间连接。为验证模型的生理相关性，研究用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激内皮细胞，成功诱导了核因子κB（NF-κB）的核转位，并观察到ZO-1和肌动蛋白表达的剂量依赖性降低，证实了该模型对炎症应激的有效响应。

建立静态培养下的多细胞BBTB模型

为了模拟BBTB的复杂性，研究在μPCs平台上建立了多细胞共培养体系。首先，人胶质母细胞瘤U87细胞被证明可以单独在μPCs上粘附和生长。随后，在预先形成内皮层（HUVECs或hCMEC/D3）的μPCs上共培养U87细胞。免疫荧光染色（使用CD31标记内皮细胞，GFAP或S100标记胶质瘤细胞）显示两种细胞类型可在μPCs上共存。值得注意的是，尽管μPCs上的内皮细胞在共培养时基线CD31表达高于2D，但与未共培养的对照组相比，CD31表达仍显著降低。同时，与血管通透性相关的plasmalemma vesicle-associated protein（PLVAP）在共培养条件下的表达显著上调（约2.7倍）。这些变化表明胶质瘤细胞破坏了内皮细胞的连接和屏障功能。

研究进一步引入了周细胞，这是BBB中支持血管稳定性和完整性的重要组分。使用血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β）标记周细胞，发现其可以与hCMEC/D3内皮细胞在μPCs上成功共培养，周细胞分布相对稀疏，符合其体内分布特征。Z轴切片图像显示了沿μPCs堆叠的多层细胞组织。最后，成功建立了包含内皮细胞、周细胞和U87胶质瘤细胞的三重培养模型。结果显示，与内皮细胞单独培养或内皮-周细胞共培养相比，加入胶质瘤细胞后，内皮细胞的CD31表达明显下降，这表明即使在有稳定作用的周细胞存在下，胶质瘤细胞仍能破坏内皮连接。

μPCs与微流控芯片的集成及动态流动培养

为了赋予模型流体剪切力这一关键生理因素，研究团队将2PP制造工艺直接应用于商用微流控芯片内部（即“芯片内”2PP制造）。他们开发了两种芯片集成方案：单通道芯片（实现μPCs腔内直接灌流）和双通道芯片（一个通道用于腔内灌流，另一个通道用于访问μPCs外表面并引入细胞/药物）。制造过程涉及优化激光功率、扫描速度等参数，并采用“浸入式激光光刻”（DiLL）和油浸物镜打印相结合的两步法，以克服芯片底部界面检测和物镜工作距离的限制，确保结构在芯片内的稳定粘附和精确定位。

将HUVECs或hCMEC/D3细胞植入集成有μPCs的微流控芯片后，在生理相关的剪切应力条件下（单通道芯片~7.8 dyn/cm²，双通道芯片~6.5 dyn/cm²，雷诺数Re <1，确保层流）进行动态灌注培养。三天后，免疫荧光成像证实两种内皮细胞均能在流动条件下均匀覆盖μPCs表面，并表达CD31等连接蛋白，形成了完整的内皮单层。双通道芯片的设计尤其提供了灵活性，允许分别访问血管腔内侧和腔外侧。

结论与展望

该研究成功开发了一种基于2PP技术的新型3D微血管平台，能够高度模拟BBTB的关键特征。μPCs支架支持内皮细胞形成具有体内样形态、极化、细胞连接和屏障蛋白表达的功能性单层，并能响应病理刺激（如TNF-α）。该平台支持内皮细胞、周细胞和胶质瘤细胞的多重共培养和三重培养，能够模拟肿瘤诱导的内皮屏障破坏。通过芯片内2PP制造将其成功集成到微流控系统中，实现了在生理流动下的内皮细胞培养，证明了其与动态培养的兼容性。

该模型结合了可控的血管架构、毛细管尺度尺寸、多细胞相互作用以及潜在的灌注能力，相比传统的Transwell、常规芯片或凝胶模型具有独特优势。未来的工作方向包括在流动条件下进行功能验证（如屏障通透性、TEER测量），并进一步整合星形胶质细胞、小胶质细胞等更多BBB组分，以构建更完整的神经血管单元模型，用于脑肿瘤研究和药物筛选应用。