利用改良的Ecobody技术开发针对膜蛋白的单克隆抗体

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Development of monoclonal antibody targeting membrane protein utilizing modified Ecobody technology

本研究开发了一种针对大鼠G蛋白偶联受体54（GPR54）胞外域的多克隆抗体，通过将GPR54胞外域与链球菌蛋白G的 albumin-binding 域融合并在大肠杆菌中表达纯化，免疫兔后筛选出四对具有特异性结合的抗体对，ELISA和Western blot验证了其低交叉反应能力，展示了ECBODY技术组合轻链和重链基因用于分离稀有抗原特异性单抗的可能性。

　　

Daffa Sean Adinegoro | Teruyo Ojima-Kato | Hideo Nakano

名古屋大学生物农业科学研究生院分子生物技术实验室，日本名古屋市千种区古市町464-8601

本研究初步报告了针对大鼠G蛋白偶联受体54（GPR54）细胞外域的兔单克隆抗体的开发过程。GPR54的细胞外域（GPR54 ECD）与链球菌蛋白G的结合域融合后，在大肠杆菌中表达，经过纯化后用于免疫兔子。利用荧光标记的对应于GPR54细胞外域2区的肽段分离出抗原特异性B细胞。从这些B细胞中扩增抗体基因，克隆到载体中并转化到感受态细胞中。通过轻链和重链基因的组合配对以及无细胞蛋白合成，基于酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定出四对对GPR54 ECD具有反应性的抗体。Western blotting验证了这些抗体能够以较低的交叉反应性检测目标蛋白。本研究展示了利用抗体基因组合配对来分离稀有抗原特异性单克隆抗体的可能性。

研究片段

GPR54细胞外域及阴性对照蛋白表达质粒的构建

与大肠杆菌表达系统兼容的质粒载体pOPINF由西班牙国家癌症研究中心（CNIO）的Ines G. Munoz教授提供。大鼠GPR54的细胞外域基因（UniProt Q924U1）按照先前描述的方法（28）由Eurofin Genomics（日本横滨）合成。使用引物GPR54Pep_VecRv和GPR54Pep_VecFw通过PCR生成线性化的pOPINF载体。线性化的pOPINF与大鼠GPR54细胞外域通过连接酶进行连接。

GPR54 ECD和NCPro的表达与纯化

GPR54 ECD和NCPro的表达载体分别如图2A和B所示。相应的质粒序列见图S2和S3，蛋白质序列见图S4。大肠杆菌 C41(DE3)感受态细胞被转化了这些构建的质粒，通过调整诱导温度（25°C–37°C）并在恒定IPTG浓度（0.5 mM）下优化了表达条件。两种载体的最大蛋白表达均是在37°C时实现的。

活性抗体对的筛选

SKIK_GPR54 ECD的制备和纯化方法与GPR54 ECD相同。质粒序列见图S4，表达的蛋白质序列见图S5。

为了评估使用CFPS合成的抗体的抗原结合活性，使用了四种抗原进行ELISA检测：BSA、NCPro、SKIK_GPR54 ECD和ECL2肽。初始抗体混合物是通过混合kappa轻链和mu重链的PCR产物制备的。如图3E所示，该抗体混合物

讨论

本研究利用改进的Ecobody技术平台开发了针对GPR54细胞外域的单克隆抗体。作为概念验证，本研究重点筛选了针对GPR54可溶性细胞外部分的抗体。图1展示了本研究中使用的改进Ecobody技术流程。

抗原的设计遵循了先前报道的策略，即将目标G蛋白偶联受体的整个细胞外域与

CRediT作者贡献声明

Daffa Sean Adinegoro：撰写——初稿、可视化、方法学、实验设计。Teruyo Ojima-Kato：撰写——审阅与编辑、方法学、概念构建。Hideo Nakano：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构建。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本研究期间，作者使用了ChatGPT来提升语言表达和可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑。作者对出版物的内容负全责。

致谢

D.S.A.得到了名古屋大学“下一代研究人员和研究生转化化学生物研究THERS新标准计划”的支持。本研究还得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究资助（项目编号：JP24K01269）。作者感谢西班牙国家癌症研究中心（CNIO）的Ines G. Munoz教授在D.S.A.参加名古屋大学GTR项目期间给予的双重指导，并提供了所需的质粒。