医用气体等离子体通过衣壳氧化灭活腺病毒的机制研究：活性氧介导的抗病毒新策略

《Small》：Medical Gas Plasma Inactivates Adenoviruses via Capsid Oxidation

本综述系统阐述了医用氩气等离子体射流（kINPen）对腺病毒（AdV）的高效灭活作用及分子机制。研究证实，等离子体产生的活性氧/氮物种（ROS/RNS）可靶向腺病毒衣壳蛋白（六邻体、五邻体基底、纤维蛋白），诱导关键氨基酸氧化修饰（如组氨酸、半胱氨酸、色氨酸的+1O/+2O/+3O氧化），破坏病毒结构完整性及宿主细胞结合能力，从而阻断病毒感染。该研究为基于等离子体技术的抗病毒策略提供了理论依据，在公共卫生消毒及新疗法开发领域具有转化潜力。

　　

摘要

医用气体等离子体技术作为一种新型抗病毒手段，其作用机制尚不明确。本研究利用临床级氩气等离子体射流（kINPen）处理人腺病毒5型（AdV），发现90秒处理即可使病毒感染力降低96%。通过动态感染监测、高内涵成像及代谢活性检测，证实等离子体处理可剂量依赖性抑制AdV在A549肺细胞中的复制。进一步研究揭示，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、酪氨酸以及一氧化氮清除剂carboxy-PTIO可逆转等离子体的病毒灭活效果，表明羟基自由基（·OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO^?）等活性成分为关键效应分子。

材料与方法

采用A549细胞系及表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组AdV病毒模型。通过光学发射光谱（OES）表征等离子体生成的活性物种，包括·OH、O₃、H₂O₂、O₂^?·、NO等。利用滴定硫酸法、细胞色素c实验及Griess法分别定量H₂O₂、超氧化物（O₂^?）及亚硝酸盐（NO₂^?）/硝酸盐（NO₃^?）。通过高分辨率质谱（HRMS）结合生物信息学分析，定位衣壳蛋白的氧化修饰位点。

结果

1. 1.
   等离子体参数与ROS量化
   等离子体处理90秒仅使液体温度升高约1.79°C，远低于病毒热灭活阈值。OES检测到典型活性物种发射峰。H₂O₂、NO₂^?、NO₃^?浓度随处理时间延长显著上升，超氧化物在短时处理（10秒）内即明显增加。
2. 2.
   AdV感染动力学监测
   高内涵成像显示，AdV感染呈MOI（感染复数）及时效依赖性，感染72小时后细胞代谢活性显著降低。算法驱动的图像分析可量化GFP表达区域及DAPI⁺死亡细胞动态变化。
3. 3.
   等离子体灭活病毒效果
   等离子体处理30秒即可显著降低病毒感染力，90秒处理几乎完全阻断感染。病毒预处理可逆转AdV诱导的细胞代谢抑制，且等离子体单独处理对细胞无毒性。
4. 4.
   ROS清除剂验证关键物种
   广谱抗氧化剂NAC及特异性清除剂（如cPTIO、SOD）可部分恢复病毒感染力，表明O₂^?、ONOO^?及·OH在灭活过程中起核心作用。组氨酸、半胱氨酸等靶向清除剂亦显保护效应。
5. 5.
   病毒结构氧化修饰分析
   透射电镜（TEM）显示等离子体处理导致病毒颗粒直径缩小16.5%（从82.9 nm至69.2 nm），衣壳结构破裂伴内容物泄漏。质谱鉴定到六邻体、纤维蛋白、五邻体基底中组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基的特异性氧化修饰。六邻体蛋白的塔状环区（aa 137-319、419-460）氧化程度最高（修饰率80-90%），而内部区域几乎无氧化。纤维蛋白的AB环（结合CAR受体）及DG环（结合CD46）内关键半胱氨酸（Cys411）发生三氧化（+3O），可能破坏二硫键稳定性。

讨论

非包膜腺病毒衣壳蛋白的氧化修饰是等离子体灭活的主要机制。活性氧通过攻击衣壳表面暴露区域的电子富集氨基酸（如色氨酸、组氨酸），引起蛋白构象改变，干扰病毒与宿主受体（CAR、整合素）结合及内化过程。与包膜病毒相比，腺病毒因无脂质包膜，对ROS的敏感性相对较低，但其衣壳蛋白的氧化损伤足以有效阻断感染链。本研究为等离子体技术应用于病毒消毒及抗病毒疗法开发提供了分子层面的证据。

结论

气体等离子体可通过活性氧介导的衣壳蛋白氧化修饰，有效灭活腺病毒。该技术具有常温操作、无化学残留等优势，在医疗器械消毒、公共场所感染控制及新发病毒应对领域具广阔应用前景。