《Cell Death & Disease》：NRF1 is upregulated by docosahexaenoic acid to ameliorate MASH through the inhibition of ER stress
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【编辑推荐】面对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）有效治疗靶点有限的困境，本研究揭示了转录因子NRF1在MASH肝组织中表达下调是关键病理环节。研究人员发现，二十二碳六烯酸（DHA）可通过抑制E3连接酶FBW7和HRD1与NRF1的相互作用，阻断其泛素化降解，从而增强蛋白酶体功能、缓解内质网应激（ER stress）和氧化应激，最终改善MASH病理表现。该研究不仅阐明了NRF1在MASH中的核心保护作用，还为DHA的临床应用提供了新的分子依据。
随着全球饮食模式的改变和肥胖患病率的上升，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）的发病率逐年攀升。虽然大多数MAFLD患者停留在单纯性脂肪肝阶段，但约有20%的患者会进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），其特征是肝损伤、炎症和纤维化。尽管MASH流行，但由于对其复杂发病机制的了解模糊，有效的治疗选择非常有限。多种因素，包括遗传易感性、内质网应激（ER stress）、氧化应激和细胞凋亡，都导致了MASH患者的严重肝损伤。作为MASH的基本特征，肝损伤启动了称为损伤相关分子模式（DAMPs）的分子的释放，进一步导致炎症和纤维化。因此，靶向代谢通路以减轻肝损伤是一个有吸引力的治疗干预范式。
泛素-蛋白酶体系统（UPS）对于清除受损和无功能的蛋白质、维持细胞氨基酸池的平衡以及保持细胞蛋白质稳态至关重要。越来越多的证据表明，蛋白质稳态失调会导致肝损伤的加剧。在这项研究中，我们重点关注了蛋白酶体在MASH相关肝损伤中的作用及其具体调控机制。核因子E2相关因子1（NRF1，也称为NFE2L1）是一种内质网定位的转录因子，据报道是哺乳动物中蛋白酶体亚基转录的主要调节因子。因此，我们旨在探讨NRF1介导的蛋白酶体转录调控在MASH进展中的潜在作用。
NRF1通常被认为是蛋白酶体丰度的负反馈调节因子，以防止蛋白毒性；然而，其在肝细胞中的自然调控机制尚不清楚。考虑到NRF1作为感应脂质成分传感器的潜力，以及二十二碳六烯酸（DHA）在蛋白酶体活性中的潜在调控作用，我们将DHA视为NRF1的天然调节剂。DHA是一种必需的ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA），以其强大的抗炎特性而闻名。先前的报告已经证明了DHA在多种肝脏疾病中的有益作用，包括MAFLD和肝硬化。我们假设DHA可能通过影响NRF1表达来改善MASH。
在这项研究中，我们发现MAFLD患者肝组织中NRF1的表达低于健康个体。我们确定NRF1是一个基础调节因子，通过促进蛋白酶体介导的蛋白质降解并进一步抑制内质网应激来减轻MASH相关的肝损伤。此外，DHA上调了NRF1的表达，介导了其对MASH的保护作用。机制研究表明，DHA抑制了NRF1与其E3连接酶在内质网膜上的相互作用，从而阻止其通过UPS发生泛素化和随后的降解，导致全长NRF1的积累。
本研究的关键技术方法包括：利用基因表达综合（GEO）数据库进行生物信息学分析；使用高脂饮食（HFD）和CCl4联合西方饮食（WD）构建小鼠MASH模型；通过腺相关病毒8型（AAV8）介导实现小鼠肝特异性NRF1过表达或敲低；采用蛋白质印迹（Western blot）、免疫组织化学/免疫荧光染色、免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白表达与相互作用；通过荧光素酶报告基因检测评估NRF1转录活性；使用细胞活力检测（CCK-8）、乳酸脱氢酶（LDH）释放和活性氧（ROS）水平测定评估细胞损伤与应激；对来自患者的肝组织样本（健康n=10，MAFLD n=20）进行了NRF1表达分析。
研究结果
肝NRF1表达在MASH患者和模型中降低
通过分析GEO数据库数据，发现MASH患者与MAFL患者相比，UPS相关基因存在差异表达。在AML12和Huh7细胞中，用游离脂肪酸（FFAs）处理12小时可上调NRF1表达，但长时间处理导致其表达显著降低。在高脂饮食（HFD）诱导的小鼠MASH模型中，肝NRF1表达显著下调，而反映蛋白酶体降解能力的泛素表达增加。免疫组化分析证实了HFD喂养小鼠肝组织中NRF1的下调，并且NRF1主要围绕中央静脉而非汇管区表达。对来自GEO数据库的肝分区图谱分析显示，NRF1表达从中央静脉向汇管区逐渐降低。在慢性肝纤维化模型（CCl4处理伴或不伴西方饮食）中，肝NRF1表达降低而泛素表达增加。对来自GEO数据库的MAFLD或MASH患者NRF1表达谱分析发现，与健康对照相比，肥胖个体NRF1表达不变，但在MAFLD或MASH患者中显著降低。收集经病理证实的MAFLD患者肝组织也发现NRF1表达显著降低。
肝特异性过表达NRF1改善MASH
通过AAV8介导肝特异性过表达NRF1的小鼠，喂养HFD 20周后，发现NRF1过表达改善了HFD诱导的肝脏变色和肥大体積。NRF1过表达显著降低了体重和肝脏重量，但不影响白色脂肪重量，表明NRF1对肝脏具有特异性保护作用。肝组织H&E染色显示，NRF1过表达减轻了肝脂肪变性、肝细胞气球样变和炎症细胞浸润。此外，肝特异性NRF1过表达降低了HFD喂养诱导的血清氨基转移酶水平升高。炎症也得到缓解，炎症因子（Tnfα, Il1β, Il10）的转录水平降低。考虑到NRF1是调节蛋白酶体亚基的主要转录因子，研究发现NRF1过表达小鼠中蛋白酶体亚基的转录和蛋白水平均增加，表明蛋白酶体丰度的增加导致了无功能蛋白质的降解。
DHA上调NRF1表达并促进其核转位
为了确定NRF1在MASH中的调控机制，检测了不同脂肪酸刺激下肝细胞中NRF1的表达。在HepG2和AML12细胞中，单独用各种脂肪酸刺激可上调NRF1表达。其中，饱和脂肪酸（SFA）棕榈酸（PA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）油酸（OA）轻微增加NRF1表达，而多不饱和脂肪酸（PUFAs）花生四烯酸（AA）、亚麻酸（LA）和DHA显著增加NRF1表达。且DHA以浓度依赖性方式增加NRF1表达。值得注意的是，DHA主要增加了NRF1切割形式的表达，而非全长形式。然而，在DHA处理的肝细胞和未刺激的肝细胞之间，未观察到NRF1转录水平的明显差异，表明DHA主要通过抑制降解而非促进转录来增加NRF1表达。考虑到NRF1的切割形式可以转移到细胞核中并作为转录因子发挥作用，评估了DHA是否影响NRF1的核转入。HepG2细胞的免疫荧光显示，在没有刺激的情况下，大部分NRF1位于细胞质中，而不饱和脂肪酸（包括MUFAs和PUFAs）促进了其核转入，而PA刺激并未显著增加NRF1的核转位。核质分离实验证实，与其他脂肪酸相比，DHA更显著地促进了NRF1的核转入。荧光素酶报告基因检测也显示，DHA确实促进了NRF1的转录功能；然而，突变抗氧化反应元件（ARE，NRF1可与之结合的顺式作用转录调控元件）则废除了DHA对NRF1功能的促进作用。可以预见，蛋白酶体亚基的mRNA水平也被DHA增加。这些结果表明，与其他脂肪酸相比，DHA更显著地上调NRF1并促进其核转位。
DHA抑制NRF1的泛素化和降解
在各种脂肪酸中，DHA显著上调NRF1表达，本研究深入探讨了DHA调控NRF1表达的具体分子机制。首先，用放线菌酮（CHX）处理HepG2细胞以抑制蛋白质合成，反映了NRF1的降解速率。在生理条件下，NRF1的半衰期较短，约为15分钟，其中全长形式的NRF1主要被降解。然而，DHA处理显著将NRF1的半衰期延长至40分钟，表明DHA通过抑制其降解来稳定NRF1。接下来，试图阐明DHA促进NRF1积累的具体降解途径。值得注意的是，用经典的蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转了DHA诱导的NRF1蛋白水平增加，而用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理并未改变DHA的效果。由于已知NRF1通过UPS降解，我们重点关注了三个先前报道的E3泛素连接酶，它们可能负责DHA介导的NRF1稳定化。免疫共沉淀实验表明，NRF1与其胞质E3连接酶FBW7（Skp1-Cul1-F-box蛋白泛素连接酶复合物的适配器）和HRD1（内质网相关降解泛素连接酶）的相互作用因DHA的加入而受损。然而，NRF1与其核E3连接酶β-TrCP（SCF泛素连接酶复合物的适配器）的相互作用不受DHA影响。正如预期的那样，NRF1的泛素化也被DHA抑制。我们进一步试图确定DHA影响NRF1降解的亚细胞位置。因此，我们生成了NRF1的N端缺失突变体（Δ1-103），代表位于细胞核中的NRF1活性形式。我们观察到DHA选择性地上调了NRF1的全长形式，但对活性形式没有影响，表明DHA特异性抑制了细胞质中而非细胞核中NRF1的降解。鉴于DHA促进了NRF1的核转位，我们评估了NRF1的切割，发现DHA增强了天冬氨酸蛋白酶DDI2对NRF1的切割，从而促进了活性形式的核转入。这些发现表明，DHA抑制了UPS在内质网膜而非细胞核中对NRF1的降解。
在MASH背景下DHA增加NRF1表达
我们给小鼠喂食含有4% DHA的HFD 20周，以进一步了解DHA在MASH背景下对NRF1的关键调控。与先前的研究一致，DHA喂养显著减轻了HFD引发的肝脂肪变性、肝细胞气球样变性、肝损伤和炎症。氧化应激也通过添加DHA得到缓解，肝丙二醛（MDA）水平显著下调。我们随后检测了肝组织中的NRF1表达。免疫荧光、免疫组织化学和免疫印迹显示，HFD喂养小鼠的NRF1表达降低，而在饮食中添加DHA有效地逆转了这种降低。值得注意的是，与中间区和汇管区相比，DHA优先上调了中央静脉周围区域NRF1的表达，这与肝脂肪变性得到最显著改善的区域一致。正如预期的那样，DHA增加了蛋白酶体亚基的mRNA水平，而这些基因在HFD诱导的MASH中是下调的。这些数据表明，DHA在MASH背景下增强了NRF1的表达，并保护肝脏免受MASH进展的影响。
考虑到NRF1在多个器官中的普遍表达，我们研究了DHA是否在肝脏以外的组织中介导NRF1的上调。在喂食含有DHA的HFD的小鼠中，我们也观察到白色脂肪组织中NRF1表达的显著上调，这在人SW872脂肪细胞中得到了进一步证实。尽管DHA对NRF1表达具有全身性效应，但DHA补充特异性地降低了肝脏重量，而不改变白色脂肪组织质量和体重。我们的结果表明，虽然DHA调节了多个组织中NRF1的表达，但其在MASH中的治疗益处似乎主要是通过肝脏特异性效应介导的。
肝NRF1的缺失逆转了DHA对MASH的保护作用
为了进一步阐明NRF1在DHA介导的MASH保护作用中的重要性，我们生成了通过AAV8驱动肝特异性敲低NRF1的小鼠，然后给小鼠喂食纯HFD或含有4% DHA的HFD 20周。通过对肝脏的大体观察、肝组织的H&E染色和肝脏重量记录，我们发现添加DHA保护了肝脏免受HFD诱导的脂肪变性和肝损伤，而这种保护作用被肝特异性NRF1敲低所逆转。此外，在WT小鼠中，肝组织中的炎症被DHA改善，但在NRF1敲低小鼠中没有改善，这通过炎症因子（Tnfα, Il1β, Il10）的基因表达表明。然后我们评估了蛋白酶体丰度，发现蛋白酶体亚基的蛋白和mRNA水平都因添加DHA而增加，而肝特异性NRF1敲低抑制了DHA的促进作用。这些结果表明，DHA在MASH中诱导的蛋白酶体丰度增加依赖于肝NRF1。
为了进一步验证我们的发现，我们随后在NRF1敲除的AML12细胞中进行了体外实验。在FFA诱导的细胞MASH模型中，NRF1的缺陷逆转了DHA的保护作用，表现为上清液中乳酸脱氢酶（LDH）释放增加、CCK-8法评估的细胞活力降低以及碘化丙啶（PI）阳性死细胞增加。为了研究蛋白酶体活性对DHA介导的肝损伤保护作用的贡献，我们用MG132处理细胞。值得注意的是，MG132逆转了DHA的改善作用，表现为上清液中LDH水平的重新升高。这些发现表明，DHA对NRF1的上调解释了其对MASH肝损伤的保护作用，特别是通过增加蛋白酶体丰度。
NRF1通过抑制内质网应激改善MASH中的肝损伤
为了阐明NRF1减轻MASH进展的潜在机制，我们研究了NRF1依赖性基因表达，并对FFA处理的WT和NRF1缺陷型AML12细胞进行了转录组分析。RNA-seq分析鉴定出363个差异表达基因（DEGs），在NRF1敲除细胞中包含149个上调和214个下调的转录本。火山图中NRF1转录的显著降低验证了我们RNA-seq数据的可靠性。此外，GO富集分析表明，最显著富集的通路涉及对内质网超负荷应激的反应、内质网应激中的凋亡信号通路或对未折叠蛋白的反应。基因集富集分析（GSEA）进一步证实了未折叠蛋白反应和凋亡通路的显著失调。因此，我们的转录组分析在NRF1主导的蛋白酶体丰度与内质网应激，特别是内质网相关蛋白降解（ERAD）通路之间建立了稳健且高度可重复的联系。
未折叠蛋白反应信号和由脂毒性细胞损伤引发的慢性内质网应激已被证明驱动细胞死亡和炎症，促进MASH的进展。在这里，我们显示DHA改善了内质网应激，表现为喂食HFD 20周的小鼠中eIF2α的磷酸化以及下游ATF4和CHOP的激活增加。然而，NRF1缺陷逆转了DHA对内质网应激的有益作用。为了确定内质网应激在NRF1对MASH保护作用中的角色，我们用内质网应激诱导剂衣霉素处理AML12细胞。CCK-8实验结果、上清液中的LDH水平和PI染色结果均表明，衣霉素和MG132处理都逆转了NRF1对FFA诱导的肝损伤的保护作用。这些结果表明NRF1通过抑制内质网应激来减轻MASH中的肝损伤。
NRF1减轻MASH中由内质网应激引发的氧化应激
越来越多的证据强调了氧化应激在代谢应激诱导的MASH发病机制中的关键作用。我们的研究显示，DHA显著降低了FFAs诱导的细胞活性氧（ROS）积累，而这种作用被蛋白酶体抑制所逆转。此外，NRF1的缺失废除了DHA对抗氧化应激的保护作用，这通过细胞ROS水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性表明。相反，NRF1的过表达减轻了MASH中的氧化应激，表现为ROS水平降低和氧化产物8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OH-dG）水平降低。考虑到内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）信号在NRF1对MASH保护作用中的关键作用，我们用衣霉素或MG132处理AML12细胞。对ROS水平和8-OH-dG水平的检测表明，衣霉素或MG132处理逆转了NRF1对抗氧化应激的保护作用。这些结果表明，NRF1减轻了MASH中由内质网应激和UPR引发的氧化应激。
NRF1，而非NRF2，通过增加蛋白酶体丰度改善MASH中的肝损伤
虽然NRF1和核因子E2相关因子2（NRF2，也称为NFE2L2）都属于CNC家族转录因子并调节ARE依赖性基因，但我们的研究揭示了这两个旁系同源物在MASH发病机制中的关键功能区别。首先，我们发现是NRF1而非NRF2控制着蛋白酶体亚基的转录。其次，与NRF1表达不同，NRF2表达不受DHA处理的影响。第三，NRF2的过表达未能减轻FFA诱导的肝细胞损伤，这通过上清液中LDH水平的检测表明。这些发现表明，NRF1在蛋白酶体亚基的转录调控以及DHA介导的MASH肝损伤保护作用中扮演着与NRF2不同的角色。
研究结论与意义
本研究旨在阐明MASH进展的关键分子机制，为开发新的治疗策略奠定基础。我们重点关注了转录因子NRF1，它是蛋白酶体生物发生的核心调节因子。在此，我们证明了NRF1在MASH进展中扮演着关键的病理生理学角色，其在实验模型和临床标本中的表达均下调，并伴有蛋白酶体活性受损。此外，肝特异性过表达NRF1显著增加了蛋白酶体丰度并改善了MASH，表现为脂肪变性减轻、肝损伤缓解、炎症细胞浸润减少和肝纤维化抑制。这些发现提供了令人信服的实验证据，将NRF1确立为一个主要调节因子，主要通过增强蛋白酶体介导的错误折叠和受损蛋白质的降解来减轻MASH。
先前的研究表明，NRF1的缺失影响胆固醇、甘油三酯和葡萄糖代谢，并减弱了对ROS、蛋白毒性和受损自噬的防御。特别是，NRF1的缺陷导致小鼠肝脏中的细胞凋亡、脂肪变性和自发性肿瘤发展。然而，这些表型背后的机制尚不清楚。在此，我们提出NRF1通过抑制肝细胞中的内质网应激来减轻MASH的脂肪变性、肝损伤、炎症和纤维化。不可否认，内质网在维持蛋白质稳态中起着关键作用，未折叠蛋白的积累会引发内质网应激并启动UPR通路。严重且未解决的内质网应激导致持续的UPR激活，导致细胞死亡、炎症小体激活和进行性肝损伤。NRF1通过增强UPS活性来促进未折叠蛋白的清除，从而抑制内质网应激，进而减少氧化应激并防止细胞死亡。
值得注意的是，尽管NRF1在不同细胞类型中普遍表达并控制蛋白酶体亚基的转录，但其表达和激活的调控机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了DHA，一种具有已确立肝脏保护特性的长链PUFA，探讨了其在蛋白酶体介导的蛋白质降解中先前未被认识的作用。就DHA而言，研究最深入的是其通过抑制促炎细胞因子和增强抗氧化防御的抗炎特性。然而，DHA对抗肝损伤的保护作用研究较少。在此，我们首次提出DHA可能通过上调NRF1来改善肝损伤。
对调控机制的进一步研究揭示，DHA特异性阻止了NRF1在内质网膜而非细胞核中的泛素化和降解，导致全长NRF1的积累。此外，DHA影响了NRF1与其加工蛋白酶DDI2的相互作用，从而促进了NRF1的激活和核转位。这提出了一个关于DHA选择性上调胞质NRF1的有趣问题。考虑到DHA是细胞膜磷脂的关键组成部分，据报道它通过扰动细胞膜的稳定性和规则性来影响膜蛋白的功能。我们提出一个模型，其中DHA掺入内质网膜磷脂，由于DHA特殊的三维形状扰乱了脂双层的规则排列；然后，位于内质网膜的全长NRF1被扰动并从内质网腔翻转至细胞质，在那里它可以被胞质蛋白酶DDI2识别和切割，生成NRF1的活性形式。
我们的研究阐明了NRF1和NRF2的 distinct 特征，它们都是CNC家族转录因子的成员，可激活ARE驱动的基因。虽然这些因子共享某些特征，但几条证据表明它们的功能并非冗余。首先，先前的研究表明，NRF1而非NRF2对于胚胎发育是不可或缺的。其次，在代谢方面，NRF1而非NRF2的缺陷促进了 distinct 的细胞适应。此外，尽管它们共享结合ARE序列的能力，但它们下游的基因表达谱显著不同。已经提出了几种潜在的分子机制。就蛋白质结构而言，NRF1的N端延伸包括一个额外的155个氨基酸的多肽，这导致NRF1被导向内质网（ER），而NRF2位于细胞质中。考虑到细胞摄取的大部分DHA被转化为膜磷脂的组成部分，我们推测DHA干扰了膜流动性和脂筏结构，从而影响了NRF1与E3连接酶之间的相互作用。这导致了NRF1的积累。然而，NRF2位于细胞质中，可能不会通过改变膜的流动性而受到DHA的影响。总的来说，NRF1独特的亚细胞定位和功能可能部分解释了其对DHA处理的独特反应，这与NRF2不同。
总之，我们的研究首次强调，NRF1表达降低和随之而来的蛋白酶体降解功能受损，通过加剧内质网应激和随后的不可逆氧化损伤，是驱动MASH进展的关键。此外，我们确定了一个新的调控轴，将DHA补充与NRF1稳定化和蛋白酶体激活联系起来，显著增进了我们对MASH中细胞适应性反应的理解。这些发现为NRF1在疾病发病机制中的内源性调控机制提供了重要见解。我们的工作不仅阐明了NRF1生物学的基本方面，而且通过靶向这个先前未知的蛋白质稳态通路，为MASH治疗开辟了新的治疗途径。
