间充质干细胞通过CCR7-ERK/JNK信号轴修复子宫内膜损伤并维持妊娠的机制研究

《Stem Cells International》：Mesenchymal Stem Cells Restore Endometrial Integrity and Sustain Pregnancy via CCR7-ERK/JNK Signaling Modulation

本文揭示了间充质干细胞（MSCs）通过调控CCR7-ERK/JNK信号通路，促进子宫内膜修复并改善复发性流产（RPL）的新机制。研究发现，MSCs可上调子宫自然杀伤（uNK）细胞CCR7表达，激活ERK/JNK信号，进而促进子宫内膜增殖（Ki67+细胞增加）并改善胚胎留存率（190%提升）。该研究为MSCs治疗不明原因RPL提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

引言

复发性流产（RPL）指连续发生两次及以上、妊娠20周前的自然流产，影响1%-5%的育龄女性，其中近半数病因不明。子宫免疫稳态失衡，特别是子宫自然杀伤（uNK）细胞功能异常，是RPL的重要病因。uNK细胞（CD56⁺CD16^-）在螺旋动脉重铸、滋养细胞侵袭和子宫内膜基质修复中发挥关键作用。间充质干细胞（MSCs）具有强大的免疫调节和组织修复能力，但其在RPL治疗中调控uNK细胞迁移和活化的空间协调机制尚不明确。CCR7作为引导淋巴细胞归巢的趋化因子受体，近期被发现参与早期妊娠中uNK细胞的迁移。本研究提出假设：MSCs通过CCR7-ERK/JNK信号轴双向调节uNK细胞动态和子宫内膜基质修复，从而维持妊娠。

材料与方法

研究采用乙醇诱导的大鼠子宫内膜损伤模型模拟RPL。40只雌性SD大鼠随机分为4组：PBS对照组、乙醇损伤模型组、低剂量MSCs治疗组（1×10⁵细胞/只）和高剂量MSCs治疗组（4×10⁵细胞/只）。MSCs来源于健康足月剖宫产产妇的脐带，经流式细胞术鉴定表型（CD44⁺/CD73⁺/CD90⁺，CD34^-/CD45^-/MHCⅡ^-）并具备成骨、成脂分化能力。通过transwell共培养系统分析MSCs对NK92细胞的免疫调节作用，利用RNA测序（RNA-Seq）、Western blot、免疫荧光等技术检测CCR7、p-ERK、p-JNK表达。采用siRNA敲低CCR7及抑制剂（SP600125抑制p-JNK，PD98059抑制p-ERK）验证通路机制。妊娠第21天采集血清和子宫组织，通过ELISA检测细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10），H&E和Masson染色评估组织形态，免疫组化分析Ki67阳性细胞比例。

结果

剂量依赖性乙醇诱导的子宫内膜损伤模型

形态学和组织学分析显示，乙醇处理可导致子宫壁变薄、腺体密度降低、上皮分层完全丧失，并伴有明显淋巴细胞浸润和胶原沉积减少。最大损伤发生在0.3–0.4 μL/g浓度。定量分析证实乙醇显著降低子宫内膜厚度和腺体数量（p < 0.05），而MSCs治疗可逆转这些变化。

MSCs的分化与表征

原代（P0）和传代（P1）脐带来源MSCs均呈现典型的纺锤形、成纤维细胞样形态。体外三系分化实验证实其多能性：成骨诱导21天后形成明显钙结节（阿尔新红染色阳性），成脂诱导14天后出现脂滴积累（油红O染色阳性）。流式细胞术显示细胞高表达MSCs标志物（CD44⁺/CD73⁺/CD90⁺），不表达造血细胞标志物（CD34^-/CD45^-）和MHCⅡ类分子。尾静脉注射MSCs的裸鼠未形成肿瘤，表明其生物安全性。

RNA-Seq分析揭示MSCs共培养后NK92细胞的关键通路

RNA-Seq分析显示，与PBS对照组相比，MSCs共培养可诱导NK92细胞发生显著的转录重编程，其中高剂量MSCs组差异表达基因最多（上调2876个，下调2584个）。基因本体（GO）富集分析发现，MSCs处理显著富集到自然杀伤细胞分化调节、免疫激活、MAPK信号通路等条目。热图显示CCR7在MSCs处理组中一致性上调。

MSCs治疗通过CCR7⁺NK细胞浸润增强子宫内膜再生

在乙醇损伤模型中，MSCs治疗可剂量依赖性地恢复子宫内膜形态，增加胶原沉积，提高胚胎留存率（从2.4个胚胎增至7个）。免疫荧光和Ki67染色显示，MSCs可恢复子宫内膜细胞增殖，增加NCR⁺CCR7⁺NK细胞比例。血清ELISA分析表明，MSCs治疗可降低促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）水平，升高抗炎因子IL-10水平。

CCR7上调介导MSCs诱导的NK92细胞ERK/JNK通路激活

Western blot结果显示，MSCs共培养可剂量依赖性地上调NK92细胞CCR7表达，并激活p-JNK和p-ERK。使用CCR7拮抗剂可抑制p-JNK和p-ERK的磷酸化。通路抑制剂实验进一步证实，PD98059（p-ERK抑制剂）和SP600125（p-JNK抑制剂）可分别阻断MSCs诱导的ERK或JNK磷酸化。CCR7敲低实验表明，MSCs对ERK/JNK通路的激活依赖于CCR7。

MSCs疗法通过CCR7/ERK/JNK信号增强子宫内膜增殖

免疫组化显示，MSCs治疗可剂量依赖性地扩大p-JNK和p-ERK阳性表达区域，增加Ki67阳性细胞比例。CCR7拮抗剂或ERK/JNK通路抑制剂均可逆转MSCs促增殖效应。定量分析证实，MSCs组的Ki67阳性细胞百分比显著高于PBS组，而MSCs+PD和MSCs+SP组则显著低于MSCs单独处理组。

讨论

本研究首次阐明MSCs通过CCR7-ERK/JNK信号轴协调子宫内膜修复和uNK细胞免疫调节的双重机制，为MSCs治疗不明原因RPL提供了新靶点。尽管乙醇损伤模型存在局限性，但研究结果揭示了MSCs在促进子宫内膜基质修复和改善妊娠结局方面的治疗潜力。未来研究应聚焦于MSCs分泌的关键因子及其临床转化应用。