《Austral Ecology》：A Comparison of Immune Function and Physiological Stress in Three Populations of the Southwestern Snake-Necked Turtle (Chelodina oblonga) Along an Urbanisation Gradient
编辑推荐：
本文比较了珀斯都市区三种不同城市化程度湿地中西南蛇颈龟（Chelodina oblonga）的健康指标，包括体况（scaled mass index）、血糖浓度、杀菌能力（bactericidal capacity）和异嗜细胞:淋巴细胞比率（H:L ratio）。研究发现城市化程度与健康指标无显著关联，表明成年龟对城市化引起的栖息地干扰具有较强生理韧性。研究强调，种群数量下降可能源于繁殖栖息地丧失或幼体高死亡率，而非成体健康受损。
引言
城市化通过栖息地破坏、引入捕食者和道路死亡率导致生物多样性下降和种群数量减少。更渐进的人口下降也可能通过间接影响个体健康而发生。此类下降可能是由于城市化造成的干扰作为环境压力源，诱导动物的生理应激反应，随后降低个体的生存和繁殖适应度。对个体健康的负面但亚致死影响可能难以检测，特别是在许多爬行动物等长寿物种中，尽管几乎没有或没有幼体补充，成体种群可能仍然存在。
在爬行动物中，仅有少数物种研究了城市化对健康和生理的影响。这些研究的结果好坏参半，即使在城市地区的种群中观察到健康指标的变化，这种变化的方向在物种之间甚至物种内部也不一致。例如，在一些种群中，城市化与更高的氧化应激、更低的生存和免疫力相关，而其他个体则表现出对城市化的习惯化。其他研究发现，城市和更自然地区的种群在基线应激测量方面没有差异。这些结果表明，城市化对个体健康的影响可能是物种特异性的，并且难以在爬行动物中预测。
西南蛇颈龟（Chelodina oblonga）是西澳大利亚西南部特有的淡水龟，该地区正在经历快速的城市化。它占据各种自然和人工水生栖息地，包括湖泊、池塘、河流和水库，是一种以大型无脊椎动物、鱼类和两栖动物为食的通用肉食动物。尽管目前被世界自然保护联盟（IUCN）的龟类和淡水龟专家小组列为“近危”物种，但这一状态已有数十年未更新。历史上，该物种在珀斯周围的天鹅海岸平原上常见且分布广泛，但城市化和土地转为农业用途已导致该地区自1860年代欧洲定居以来超过70%的湿地被破坏。最近，珀斯都市区自1950年代以来经历了广泛的城市扩张，导致额外的自然湿地和原生丛林丧失，并创建了多个城市湿地。由于城市湿地主要是为人类使用而建造的，它们通常具有人工维持的水位，比天鹅海岸平原上通常较浅、季节性且依赖冬季暴雨期间偶发洪水的自然湿地保持水的时间更长。城市扩张增加、水生栖息地水文状况改变以及许多西南蛇颈龟种群随之下降，导致研究工作致力于了解城市化对该物种下降的贡献。
虽然同属物种长颈龟（Chelodina longicollis）似乎受益于墨尔本地区人工创造的城市湿地，但珀斯周围城市化地区的西南蛇颈龟种群似乎在下降。对珀斯地区西南蛇颈龟种群的调查发现，大多数城市湿地很少有幼体，有些支持非常小的总体种群。许多城市湿地中明显缺乏幼体西南蛇颈龟表明这些种群缺乏近期补充。这种补充失败可能归因于与城市化相关的各种因素，例如引入捕食者的存在、水质或猎物丰度的变化，或土地用途开发减少了湿地周围合适的陆生栖息地。事实上，珀斯地区西南蛇颈龟的丰度与原生植被的可及性呈正相关，这可能对筑巢成功和幼体存活很重要。城市湿地中成体健康状况不佳也可能导致种群下降，要么直接缩短寿命，要么间接降低个体的繁殖产出，尽管这种潜在影响先前尚未探索。
本研究的目的是比较来自城市化强度不同的湿地的西南蛇颈龟种群中的若干健康指标。从具有不同栖息地干扰水平的湿地中采样成年西南蛇颈龟，以量化个体的体况、血糖浓度、先天免疫能力（测量为杀菌能力）和基线生理应激水平（测量为血液中循环的异嗜细胞与淋巴细胞比率）。这四种生物标志物常用于野生动物种群个体健康的比较研究，并且由于它们依赖于标准形态测量或小血液样本，因此是微创的。
方法
研究地点
采样于2023年11月在珀斯都市区三个城市化干扰程度不同的湿地进行。采样湿地是一个更大的西南蛇颈龟种群趋势长期研究中的站点子集，被选择来代表城市环境中各种干扰水平。这里采样的城市化程度最低的站点是The Spectacles，这是一对以纸皮树为主的淡水湿地，几乎完全被原生植被包围。城市化程度最高的站点是Hawker Street Reserve，这是一个大部分被住宅开发包围的池塘，其周边由修剪整齐的草坪组成，没有剩余原生植被。最后，Postans Court Reserve的城市化程度介于The Spectacles和Hawker Street Reserve之间：虽然湿地本身大部分被道路和郊区扩张包围，但其东侧连接到一个自然保留地，因此湿地周围200米缓冲区内23%的土地用途是原生植被。
为了量化每个采样点由于城市化造成的栖息地干扰水平，在地理信息系统中创建了代表每个湿地水生区域的多边形，并在每个水生区域多边形周围生成了200米缓冲区。随后，根据Santoro等人的方法对200米缓冲区内的土地用途进行分类，并创建了额外的多边形来代表五种土地用途类别。然后计算了三个采样点中每个土地用途类别的面积，并转换为相应200米缓冲区面积的百分比。地理空间分析在QGIS中使用缓冲区和字段计算器功能进行。
龟类捕获和血液采集
在每个研究地点对成年龟进行采样，这些地点正在为一个关于西南蛇颈龟种群补充和人口统计的持续研究进行诱捕。在每个湿地部署了改良的漏斗陷阱和带油浸沙丁鱼诱饵的袋网组合来捕获龟类。在每个湿地，6-10个陷阱在某个下午设置，留置过夜，并在第二天检查和移除。因此，龟可能在陷阱内被 containment 长达20小时，在此期间它们可以以漂入陷阱的天然猎物为食。从陷阱中取出后，首次捕获的龟立即用被动集成应答器标签进行个体标记，先前标记的龟使用便携式扫描仪进行识别。所有龟还使用电子秤称重至最接近的克，用游标卡尺测量背甲长度，并使用尾长相对于背甲长度确定性别。如上所述进行标记和测量后，对于来自三个研究地点中每个地点的7-10只成体子集，使用连接至10毫升肝素化注射器的28号针头从颈静脉采集最多0.5毫升血液。采集血样后，所有龟立即在捕获地点释放。
量化健康的指标
对于每只采样的龟，使用便携式血糖仪测量血样中的葡萄糖浓度。然后，将一滴血放在玻璃显微镜载玻片上，用玻璃盖玻片涂抹制成血涂片，然后在现场风干。血样的其余部分随后储存在1.5毫升聚丙烯微量离心管中冰上，并运送到西澳大利亚大学，在那里以2000 g离心2分钟以分离血浆和细胞，然后将血浆储存在-80°C的微量离心管中。
从野生龟采集血液后的14天内，使用冷冻血浆样本进行细菌杀伤测定，通过测量个体血液血浆中补体蛋白杀死大肠杆菌的杀菌能力来量化每个个体的先天免疫功能。对于该测定，将血浆样本应用于大肠杆菌培养物，将溶液孵育以允许血浆中的杀菌活性有时间杀死大肠杆菌，然后通过将大肠杆菌接种物被其血浆样本杀死的比例与对照样本中存在的大肠杆菌菌落数进行比较来确定每个个体的杀菌能力。简而言之，将冻干大肠杆菌的沉淀重悬于40毫升温磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并通过将一部分重悬的大肠杆菌进一步稀释至1:40来制备工作大肠杆菌溶液，这每10微升产生大约100个菌落形成单位。然后将龟血浆样本在PBS中稀释1:10，并通过将10微升工作大肠杆菌溶液加入100微升稀释血浆样本来制备样本反应。将样本反应在28°C孵育25分钟以允许细菌杀伤发生。还通过将10微升工作大肠杆菌溶液加入100微升PBS来制备两个重复对照反应，然后将对照板与大肠杆菌处理的血浆样本同时孵育。孵育后，将每个样本和对照反应的50微升等分试样铺在4%胰蛋白酶大豆琼脂上，将平板在室温下孵育36小时，并计数每个平板上的大肠杆菌菌落数。将每个平板中的菌落数除以对照平板中的平均菌落数，并将该值从1中减去以获得被杀死的细菌比例，这对应于每个个体的杀菌能力。
最后，通过量化捕获时收集的血涂片中的异嗜细胞与淋巴细胞比率来测量每个个体的基线生理应激水平。在现场制备的血涂片随后在70%乙醇中固定，然后用吉姆萨染色。为了量化每个个体的H:L比率，使用光学显微镜在100倍放大下计数每个血涂片中的100个白细胞，并将每个白细胞分类为异嗜细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或单核细胞。异嗜细胞与淋巴细胞的比率用作每个个体的基线应激水平，因此较高的H:L比率表示较高的基线生理应激水平。
统计分析
所有统计分析在R版本2023.12.1中进行。使用Peig和Green的缩放质量指数计算体况，该指数结合了异速生长尺度的变化，并且被认为比从质量对体长的普通最小二乘回归计算残差更好地指示个体能量储备的相对大小。首先使用包lmodel2计算对数转换的质量和体长数据的标准化主轴回归。然后，对于每个个体，使用Peig和Green的公式计算缩放质量指数：SMI = Mi× (L0/ Li)bSMA，其中Mi是质量，Li是背甲长度，bSMA是通过质量对背甲长度的SMA回归估计的缩放指数，L0是所有采样个体的算术平均背甲长度。用于数据分析的血糖浓度从mg/dL转换为mmol/L。使用协方差分析比较采样地点之间和性别之间的平均体况、血糖浓度、杀菌能力和H:L比率，其中背甲长度、背甲长度×地点和背甲长度×性别也作为协变量包含在血糖浓度、杀菌能力和H:L比率的分析中。当平均值在不同地点之间存在差异时，进行事后Tukey检验以确定哪些具体地点彼此不同。
结果
从城市化程度最低的地点采样了10只成年西南蛇颈龟，从中间地点采样了7只，从城市化程度最高的地点采样了9只。每个种群的平均体况、血糖浓度、杀菌能力、循环白细胞谱和H:L比率如表2所示。四个健康指标中没有一个因性别、背甲长度或背甲长度与地点或性别的交互作用而异。三个采样种群在平均体况、杀菌能力或H:L比率上没有差异。然而，地点在平均血糖浓度上存在差异。事后Tukey检验表明，城市化程度中间地点的平均血糖浓度低于其他两个地点。
讨论
在这项研究中，量化了来自因城市化导致栖息地干扰不同的湿地的成年西南蛇颈龟的若干健康指标。没有趋势表明西南蛇颈龟的缩放体况或血糖水平随着周围城市化的梯度而变化，尽管平均血糖水平在中间地点比城市化和更自然的地点都低。体况和血糖浓度都受饮食因素影响，因此体况和血糖浓度的变化可能与食物可用性或质量的变化有关。例如，接受游客补充高葡萄糖食物的鬣蜥表现出与未接触的鬣蜥不同的葡萄糖耐量。在本研究中，西南蛇颈龟的补充喂养不太可能，因为该物种在水中以大型无脊椎动物、小鱼、幼虫两栖动物为食，有时食腐，但自然可用猎物的差异可能解释了中间地点相对于城市化和更自然采样地点较低的血糖浓度。未在此量化猎物可用性，但从墨尔本两个仅相距200米的池塘采样的同属物种长颈龟在血糖浓度上也存在差异，这强化了生理变量可能受捕获地点影响，即使在短距离内。同样重要的是要承认，由于血糖浓度受个体最后一次进食的时间影响，采样前在陷阱内 containment 的时间可能比采样点本身更能预测血糖浓度。由于水生诱捕是捕获淡水龟的标准方法，很难将捕获后的时间效应与血糖基线测量分开，但比较捕获后立即测量的血糖浓度与在陷阱内 containment 几小时后测量的血糖浓度将有助于确定诱捕方法如何影响血糖浓度。类似地，在陷阱内花费时间较长的个体的杀菌能力可能低于刚进入陷阱后不久采样的个体。体况不太可能受在陷阱内花费时间的影响，尽管在陷阱内花费更多时间的个体体重可能略低，因此有更多时间排空肠道内容物。
来自更城市化湿地的西南蛇颈龟具有与更自然湿地的龟相似的杀菌能力。栖息地干扰对爬行动物免疫功能的影响好坏参半，例如，在更城市化的环境中，通过将能量投资从免疫转向繁殖。同样，在受人类发展和生态旅游影响的岛屿上的海鬣蜥比未受干扰岛屿上的海鬣蜥免疫力更低。因此，城市化和其他环境干扰有时但与爬行动物的较低免疫力无关。重要的是，此处测量的杀菌能力是免疫系统先天组成部分的反应，其特异性较低且安装的能量成本低于适应性组成部分。本研究未测量龟的适应性免疫反应，但用植物血凝素挑战沿城市化梯度的龟以比较免疫系统适应性组成部分的功能将是有价值的，因为来自更城市化湿地的龟可能在其一生中暴露于与更自然湿地的龟不同的传染源。此外，鉴于许多西南蛇颈龟种群中明显的低近期补充率，确定繁殖投资是否沿城市化梯度在种群之间不同、繁殖投资是否与免疫功能指标相关，以及繁殖投资与免疫功能之间的权衡是否独立于栖息地干扰发生将是有用的。
虽然先前的研究表明爬行动物相对于城市化的基线生理应激水平和应激反应存在广泛差异，但龟在暴露于压力环境时通常不表现出与其他脊椎动物典型的生理应激反应。龟类缺乏明显应激反应已在各种压力源和生理标志物中得到记载。类似地，在本研究中，来自因城市化导致栖息地干扰不同的湿地的西南蛇颈龟种群在基线H:L比率上没有差异。龟的生理应激水平可能在长时间的环境应激期间变得减弱，以避免损害其他功能，如繁殖或免疫力。事实上，在袜带蛇中，包括皮质酮的基线和应激诱导反应性在内的生理特征的可塑性在资源有限期间维持了两种不同生活史生态型之间的功能相似性。采样时的2023年，西澳大利亚经历了由于厄尔尼诺导致的严重干旱，这可能由于异常高温和低降雨量对所有种群造成了额外的环境压力。因此，厄尔尼诺条件可能对采样种群施加了额外的环境压力，超出了仅由城市化引起的栖息地干扰所造成的压力，因此每个种群中的龟可能通过调节其应激反应的幅度来调节对其他生物功能的负面影响。
爬行动物种群对城市化的反应多种多样，一些种群丰度下降，一些通过习惯化而持续存在，其他种群则显然受益于城市与更自然环境中呈现的新条件。与城市化相关的健康和生理变化已在各种爬行动物物种中得到记载，并且可能很大程度上归因于城市环境中改变的热和化学条件。亚致死健康影响可能导致渐进的人口下降，这可能难以检测，特别是在许多爬行动物等长寿物种中，直到为时已晚。本研究中测量的西南蛇颈龟种群健康指标并未随栖息地干扰梯度而变化。然而，这项研究仅限于相对较小的样本量，以尽量减少采集血样对动物福利的潜在影响，因此检测种群间差异的统计功效不高。此外，采样期间的厄尔尼诺诱导的干旱条件可能对所有种群施加了额外的环境压力，而不仅仅是更城市化地区的种群，从而掩盖了在更能反映平均气候条件的年份中可能检测到的健康差异。尽管如此，这些结果表明，来自更自然栖息地的西南蛇颈龟成体总体上并不比被0%–23%原生植被包围的更城市化地区的成体更健康，可能表明对城市化引起的栖息地干扰具有高水平的韧性。对墨尔本大都会同属物种长颈龟的研究同样发现，城市种群似乎对城市湿地中改变的水文状况具有韧性，有时甚至受益于此。
这项研究的结果表明，更城市化的西南蛇颈龟种群中明显的缺乏补充可能源于成体健康下降以外的因素，例如缺乏高质量的筑巢栖息地或幼体生命阶段的高死亡率。事实上，气候变化预计会对该物种的筑巢生态产生负面影响，因为筑巢雌龟使用的天气线索与增强巢存活的条件越来越脱钩。气候变化也正在影响西南蛇颈龟的孵化条件和幼体出壳触发因素。需要额外的研究来确定西南蛇颈龟低补充的原因，特别是在更城市化的地区。重要的下一步是在非厄尔尼诺年份量化健康指标，以确定干旱条件是否影响生理，生理可塑性可以在多大程度上缓冲个体免受负面健康影响，以及在这种物种中，生理可塑性是否沿人为干扰梯度而异。
