铜调控下Methylosinus trichosporium OB3b在甲烷/甲醇代谢中的生理与转录组重塑及其环境适应机制

《Environmental Microbiology》：Impact of Copper on the Physiology and Transcriptome of Methylosinus Trichosporium OB3b Grown on Either Methane or Methanol

本研究揭示了铜离子对模式甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b代谢途径的深度调控机制。研究发现，铜的存在会抑制该菌在甲醇基质上的持续生长，导致甲酸积累、培养基酸化及甲酸脱氢酶(Fdh)失活，并引发还原力(NADH/NAD比值)失衡。通过转录组分析发现，两个推测的铁载体基因簇的表达受铜和碳源（甲烷vs甲醇）协同调控，提示其在抵御氧化应激中起关键作用。该研究为理解甲烷氧化菌的碳源适应性提供了新视角。

　　

1 引言

好氧甲烷氧化菌是一类能以甲烷为唯一碳源和能源的微生物。它们通过甲烷单加氧酶（MMO）将甲烷氧化为CO₂，甲醇、甲醛和甲酸为关键中间产物。MMO存在两种形式：膜结合型颗粒甲烷单加氧酶（pMMO）和胞质型可溶性甲烷单加氧酶（sMMO）。pMMO的活性高度依赖铜离子，而sMMO仅在缺铜条件下表达。尽管甲醇是甲烷氧化的直接产物，但部分甲烷氧化菌（如Methylosinus trichosporium OB3b）在甲醇基质上的生长表现不稳定，尤其在铜存在时会出现生长抑制。本研究选取OB3b作为模型菌株，系统探究铜与碳源（甲烷vs甲醇）对其生理特性及转录组的复合影响。

2 材料与方法

实验采用硝酸盐矿物盐（NMS）培养基，设置不同铜离子浓度（0或1μM CuCl₂）及MOPS缓冲液（20mM）条件，以甲烷或甲醇（0.25% v/v）为碳源培养OB3b。通过测定菌体密度、甲酸积累量、NADH/NAD比值、金属离子含量及透射电镜观察细胞超微结构，结合RNA测序和RT-qPCR分析基因表达差异，全面解析其代谢调控网络。

3 结果

3.1 甲醇支持下的生长特性

OB3b在无铜条件下可稳定利用甲醇生长，但在有铜环境中仅能完成单次传代，第二次传代时生长完全抑制，并伴随甲酸积累（~3.8mM）和培养基pH下降（6.8→5.5）。添加MOPS缓冲液后，菌体可在“铜+甲醇”条件下恢复持续生长，且无甲酸积累。

3.2 金属离子摄取与能量代谢

铜离子存在时，菌体铜含量显著升高（0.11 vs <0.001μg Cu/mg蛋白），但碳源类型不影响铜积累。缺铜条件下，甲烷培养菌体的铁含量最高（0.6μg Fe/mg蛋白）。NADH/NAD比值在“甲醇+铜”条件下急剧升高至0.96，约为甲烷培养组的10倍，表明甲醇代谢导致还原力过度生成。

3.3 超微结构与基因表达

透射电镜显示，“甲醇+铜”培养菌体内胞质膜（ICM）结构松散或缺失，间距增大（43nm vs 甲烷培养组的18nm）。转录组分析表明，pMMO基因（pmoCAB）在铜存在时显著上调，sMMO基因（mmoXYZDBC）及甲烷素（mbn）合成基因则被抑制。两个推测的铁载体基因簇（位于染色体和质粒pOB3b3）在“甲醇+铜”条件下表达严重受阻，而在“甲醇-铜”或“甲烷+铜”条件下高表达。

4 讨论

甲醇氧化比甲烷氧化多产生50%的还原力，导致NADH/NAD比值升高和氧化应激风险。OB3b在“甲醇+铜”条件下ICM结构异常，可能影响电子传递链效率。甲酸积累与pH下降进一步抑制甲酸脱氢酶活性，形成恶性循环。MOPS缓冲液通过稳定pH帮助菌体下调碳代谢基因表达，缓解应激损伤。铁载体可能通过螯合金属离子或直接清除活性氧（ROS）参与氧化应激防御，其表达受铜和碳源的协同调控提示新的环境适应机制。

5 结论

铜通过影响ICM形成、甲酸代谢及铁载体合成等多途径调控OB3b的甲醇利用效率。该研究不仅揭示了甲烷氧化菌碳源切换的分子基础，也为优化甲醇生物制造平台提供了理论依据。