《The FEBS Journal》：Deciphering the properties and reaction mechanism of anhydromevalonate phosphate decarboxylase, a prenylated flavin mononucleotide-dependent enzyme in the archaeal mevalonate pathway
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本文系统解析了超嗜热古菌Aeropyrum pernix来源的脱水甲羟戊酸磷酸脱羧酶（AMPD）的酶学特性，首次证实其依赖新型辅酶异戊烯化黄素单核苷酸（prFMN）催化trans-脱水甲羟戊酸磷酸（tAHMP）生成异戊烯基磷酸（IP），阐明该酶通过[2+3]环加成机制实现非氧化脱羧，并发现其反应过程中可能产生乙基磷酸等副产物。研究为优化低ATP消耗的古菌甲羟戊酸途径提供了理论支撑，对萜类生物合成代谢工程具有重要指导意义。
Abstract
古菌甲羟戊酸途径作为现存所有甲羟戊酸途径的原型，其关键步骤之一是由脱水甲羟戊酸磷酸脱羧酶（AMPD）催化trans-脱水甲羟戊酸磷酸（tAHMP）生成异戊烯基磷酸（IP）。本研究以超嗜热古菌Aeropyrum pernix来源的AMPD（ApAMPD）为对象，首次系统解析了该酶对异戊烯化黄素单核苷酸（prFMN）辅酶的依赖性及反应机制。
Abbreviations
研究明确了AMPD所属的UbiD酶家族特征，其活性依赖于prFMN辅酶，该辅酶由prFMN合酶（PFS）通过还原型FMN（FMN）与二甲烯丙基磷酸（DMAP）的异戊烯化反应合成。
Introduction
古菌甲羟戊酸途径与真核途径相比，在磷酸甲羟戊酸（MVA5P）脱水生成tAHMP后，通过AMPD的脱羧反应直接生成IP，无需消耗ATP进行磷酸化，使得途径总ATP需求降至2分子，显著低于其他途径的3分子ATP。这一低能耗特性使其在萜类生物合成代谢工程中具有应用潜力。
Expression, purification, and reconstitution of ApAMPD
通过独立表达并纯化ApAMPD与ApPFS，发现纯化的ApAMPD（apo-ApAMPD）几乎无活性，需与ApPFS共孵育在含FMN、DMAP和连二亚硫酸钠的体系中生成prFMNred，再经氧化形成活性形式的prFMNiminium，获得全酶（holo-ApAMPD）。酶活分析表明，holo-ApAMPD活性显著高于apo-ApAMPD，而直接添加游离prFMNred重构的酶活性介于两者之间。
Quantification of prFMNredconcentration using MmPFS
为解决游离prFMNred定量难题，研究利用Methanosarcina mazei来源的PFS（MmPFS）与prFMNred结合后经氧化形成稳定的prFMNradical复合物，通过其554 nm特征吸收峰（ε=2.5×104M?1·cm?1）建立定量方法。结果显示ApPFS对FMN的Kd（1.14 μM）远高于MmPFS（74.7 nM），说明ApPFS更适于游离prFMN制备。
Characterization of holo-ApAMPD
酶学性质分析表明：ApAMPD最适pH为5.5–6.9，在90°C处理30分钟后仍保持稳定，100°C时活性显著降低但未完全失活；EDTA处理导致酶完全失活，表明其依赖二价金属离子（如Mn2+）；动力学分析显示对tAHMP的Km为17.0 μM，Ki为270 μM，kcat为0.519 s?1，催化效率kcat/Km达3.05×104M?1·s?1，与其他UbiD家族酶活性相当。
NMR and LC–MS analysis of the reaction products of ApAMPD
通过13C-NMR和LC–MS对酶产物分析，确认IP为主要产物，但同时检测到乙基磷酸等副产物。副产物形成可能与prFMNiminium与tAHMP的环加成中间体分解有关。实验发现当反应体系中存在连二亚硫酸盐残留时，副产物生成增加，提示反应中间体稳定性受环境因素影响。
Discussion
本研究证实ApAMPD能以较高催化效率驱动古菌甲羟戊酸途径的脱羧步骤，其低Km值（17.0 μM）与途径上游酶ApPMDh对tAHMP的Km（18.3 μM）相匹配，保障了途径流畅性。副产物的发现揭示了prFMN依赖型脱羧酶反应机制的复杂性，为优化酶催化特异性提供了新视角。
Materials and methods
研究详细阐述了ApAMPD、ApPFS、MmPFS等酶的异源表达与纯化方案，建立了prFMNred的厌氧制备与定量方法，并通过LC–MS和NMR技术实现了产物定量与鉴定，为古菌代谢酶的生化研究提供了标准化流程。
