Baicalin 通过靶向 PKM2 抑制巨噬细胞的糖酵解和琥珀酸驱动的 HIF-1α 信号通路，从而减轻由呼吸道合胞病毒（RSV）引起的炎症

《Microbial Pathogenesis》：Baicalin inhibits macrophage glycolysis and succinate-driven HIF-1α signaling by targeting PKM2 to alleviate RSV-induced inflammation

呼吸道合胞病毒感染引发过度炎症，黄芩苷通过抑制病毒复制和炎症反应发挥治疗作用，但其免疫代谢调控机制尚不明确。本研究发现黄芩苷通过抑制巨噬细胞糖酵解（靶向PKM2）和HIF-1α信号通路，减少乳酸和琥珀酸积累，从而抑制NLRP3炎症小体激活和IL-1β释放，为RSV肺炎治疗提供新靶点。

　　

何阳|谷雅倩|董莹莹|孙环|刘福双|徐海燕|杜凯|彭林秀|徐伟晨|林莉莉|谢同|单俊山|赵霞

江苏省儿童健康与中医重点实验室，南京中医药大学，南京210023，中国

摘要

呼吸道合胞病毒（RSV）感染会引发过度炎症，从而加重疾病严重程度。黄芩素通过抑制病毒复制和减轻炎症来发挥对抗RSV感染的治疗作用。然而，其在RSV感染期间发挥免疫调节作用的机制仍不明确。本研究发现，黄芩素通过调节巨噬细胞的免疫代谢来缓解RSV引起的炎症。为了研究代谢调节机制，我们进行了代谢组学分析，结果显示黄芩素应用后代谢谱发生了明显变化。进一步使用同位素示踪剂进行的代谢流分析表明，黄芩素抑制了RSV感染引起的乳酸和琥珀酸的积累。从机制上讲，黄芩素抑制了RSV感染期间的糖酵解代谢和琥珀酸驱动的缺氧诱导因子1α（HIF-1α）信号通路，从而抑制了NLR家族中的NLRP3蛋白的激活并减少了IL-1β的释放。这些效果通过使用糖酵解激活剂在体外得到验证，并通过二甲琥珀酸与RSV的共同处理进一步证实了HIF-1α介导的缺氧途径的参与。最终通过分子对接和有限蛋白水解耦合质谱技术证实了黄芩素作用于丙酮酸激酶M2（PKM2）。综上所述，这些数据阐明了黄芩素通过调节巨噬细胞的免疫代谢来缓解RSV引起的炎症的机制，这对RSV感染的治疗具有重要意义。

引言

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球病毒性呼吸道感染的主要原因，尤其会导致婴儿和免疫功能低下的老年人群出现严重的细支气管炎和肺炎。尽管随着对RSV感染周期和发病机制理解的深入，几种有前景的抗病毒疫苗候选物已经出现[1]、[2]，但这些抗病毒药物仅在症状出现时使用才最有效[3]。这一局限性凸显了需要替代治疗策略的必要性。值得注意的是，RSV感染中的组织损伤主要由宿主的先天免疫反应和相关的过度炎症过程介导[4]。因此，针对免疫调节和炎症的治疗方法有望减轻疾病严重程度并改善临床结果。

关键的是，细胞免疫代谢的重编程会促使巨噬细胞向促炎状态（例如M1样表型）极化，这是RSV感染中先天免疫和炎症反应的关键决定因素[5]、[6]。通常，病毒感染会破坏巨噬细胞的代谢稳态，引发从氧化磷酸化（OXPHOS）向糖酵解的补偿性转变[7]。这些代谢适应不仅为病毒复制提供能量，还通过NLR家族中的NLRP3蛋白/IL-1β通路等途径放大炎症反应，进一步损害肺部修复功能[8]、[9]。尽管我们之前的代谢组学研究已经发现了RSV引起的代谢变化，包括三羧酸循环和谷氨酰胺代谢[10]，但RSV感染发病机制所驱动的免疫代谢机制仍有待详细研究。

值得注意的是，局部缺氧会稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），这是一种由E3泛素连接酶Von Hippel-Lindau（VHL）介导的重要的免疫代谢调节因子，它驱动炎症反应。在RSV感染期间，免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞）通过分泌促炎细胞因子加剧气道炎症，进一步刺激黏液过度分泌[11]。这种级联反应导致气道阻塞和缺氧，从而维持炎症[12]。从机制上讲，已有研究表明RSV感染通过非氧依赖机制稳定HIF-1α[13]，直接放大其促炎效应，包括巨噬细胞极化和炎症反应[14]、[15]。相反，通过增强线粒体代谢适应性来破坏HIF-1α可以抑制巨噬细胞极化，从而减弱病毒引起的炎症反应，无论是在小鼠还是人类肺巨噬细胞中[16]。此外，RSV引起的代谢重编程会驱动内源性免疫调节代谢物（如琥珀酸、异柠檬酸和乳酸）的积累，这些代谢物对缺氧相关的炎症和巨噬细胞极化具有关键调节作用[17]、[18]。特别是在巨噬细胞中，琥珀酸受体1感知的琥珀酸已知可以激活HIF-1α通路[19]，而内源性产生的异柠檬酸（4-辛基异柠檬酸）已被证明可以稳定抗氧化和抗炎转录因子核因子红细胞2相关因子2，从而抑制HIF-1α[13]、[18]。尽管HIF-1α通路的目标对于整合糖酵解和RSV感染的治疗至关重要，但其在RSV感染治疗中的调节作用尚未得到充分阐明。

许多天然产物中的黄酮类成分正作为抗病毒、抗炎和免疫稳态调节剂发挥作用[20]、[21]。黄芩素是一种广泛分布的代表性黄酮类化合物，它通过增强I型干扰素的产生和直接结合病毒蛋白来抑制RSV复制[22]。虽然黄芩素的直接抗病毒和抗炎作用已有充分记录[22]，但其在RSV感染期间调节宿主免疫代谢稳态（如线粒体适应性或代谢物积累）的潜在作用尚未被探索。为了研究黄芩素在RSV感染期间的免疫代谢调节作用，我们探讨了其与巨噬细胞的代谢调节关系，结果发现黄芩素通过调节代谢动态和HIF-1α通路来发挥抗RSV肺炎作用。我们的发现揭示了黄芩素如何重塑巨噬细胞代谢以发挥抗RSV肺炎的效果，为严重病毒性呼吸道感染提供了一种新的治疗策略。

试剂和抗体

标准纯度的黄芩素（纯度≥99.9%）购自上海豫源生物科技有限公司（中国上海）。葡萄糖、丙酮酸、乳酸、琥珀酸、α-酮戊二酸（αKG）、富马酸、1,2-13C-肉豆蔻酸（490865，Sigma）和二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自Sigma Aldrich（中国上海）。Molidustat（BAY85-3934）和12-(环己基氨基)十二烷酸（CUDA）购自MedChemExpress（美国密尔沃基）。二乙基琥珀酸

黄芩素缓解了RSV引起的炎症和氧化应激

为了验证系统性和组织暴露情况，在给药后测量了血浆和肺组织中的黄芩素浓度。黄芩素在血浆和肺组织中均被检测到，表明其在靶器官中的药物暴露良好（图1A）。在阐明机制之前，我们首先在体内研究了黄芩素的抗RSV作用。实验期间监测了小鼠的体重。结果显示，高剂量的黄芩素显著减轻了RSV引起的体重下降

讨论

RSV是一个重大的全球健康挑战。尽管最近在mRNA和蛋白疫苗以及单克隆抗体疗法方面取得了进展[39]，但关于安全性和保护持久性的担忧仍阻碍了这些技术的广泛应用[39]。黄芩素是一种从黄芩（Scutellaria baicalensi）中提取的代表性黄酮类化合物，以其抗病毒和抗炎特性而闻名。其药理作用包括抑制AKT/mTOR、激活Nrf2等

结论

本研究系统地阐明了黄芩素抑制RSV引起的肺部炎症的代谢调节机制。从机制上讲，黄芩素抑制HK2和PKM2蛋白的表达，从而阻断糖酵解转变并减少乳酸的产生，进而抑制M1型促炎巨噬细胞的激活。此外，黄芩素调节代谢动态，防止琥珀酸的积累，促进HIF-1α的蛋白酶体降解

作者贡献声明

单俊山：监督。 何阳：撰写——初稿，可视化。 谢同：验证，监督，项目管理，资金获取，正式分析，数据管理。 董莹莹：可视化，验证。 赵霞：监督。 谷雅倩：撰写——初稿，可视化，验证。 彭林秀：验证。 杜凯：验证。 林莉莉：监督。 徐伟晨：监督。 徐海燕：监督。 刘福双：可视化，验证。 孙环：

资助

本研究得到了江苏省自然科学基金[项目编号，BK20241915]、江苏省中医药技术发展基金[项目编号，MS2022002]以及江苏省研究生实践创新计划[项目编号，SJCX24_0928]的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

缩写

ASC

含有CARD的凋亡相关斑点蛋白

BH

高剂量黄芩素

BL

低剂量黄芩素

BM

中等剂量黄芩素

BSTFA

双(三甲基硅基)三氟乙酰胺

CUDA

12-[(环己基氨基)氨基]十二烷酸

DES

二乙基琥珀酸

GSH

谷胱甘肽

HE

苏木精和伊红

HIF-1α

缺氧诱导因子1α

HK2

己糖激酶2

LDH

乳酸脱氢酶

MDA

丙二醛

MPO

髓过氧化物酶

NLRP3

NLR家族中的NLRP3蛋白

OCR

耗氧率

OXPHOS氧化磷酸化

PER质子