利用基于肽微阵列的金属增强荧光检测技术同时检测多种组织蛋白酶的活性

《Microchemical Journal》：Simultaneous detection of multiple cathepsin activities by peptide microarray-based metal-enhanced fluorescence assay

羧肽酶活性检测新方法：基于FRET-肽微阵列与金纳米棒增强荧光的同步检测技术（PMMEFA）成功应用于骨肉瘤（OS）细胞系、血清和组织样本中五种羧肽酶（B/D/G/K/L）的活性分析，展现出低检测限（3.4-4.3 fg/mL）和高特异性，为肿瘤侵袭转移机制研究提供新工具。

　　

李莎莎|张婉玉|李振生南|王振鑫

中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室，中国长春 130022

摘要

组织蛋白酶（CTSs）在骨肉瘤（OS）等肿瘤的侵袭和转移过程中起着关键作用。本文开发了一种基于F?rster共振能量转移（FRET）-肽微阵列的金属增强荧光（MEF）检测方法（PMMEFA），用于同时检测多种CTSs的活性。该方法将含有FRET对（供体FAM和受体Dabcyl）的CTS肽底物固定在聚（缩水甘油甲基丙烯酸酯-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯）包覆的金纳米棒（GNR@P(GMA-HEMA)修饰的显微镜载玻片上。在CTS存在下，酶促切割会破坏FRET效应，从而恢复荧光信号，该信号通过GNR的MEF效应得到进一步增强。通过计算相应肽底物的荧光恢复率可以定量分析CTSs的活性。PMMEFA具有宽动态范围、优异的特异性和较低的检测限（LODs：CTS B为3.4 fg mL^-1，CTS D为25.5 fg mL^-1，CTS G为1.4 fg mL^-1，CTS K为2.5 fg mL^-1，CTS L为4.3 fg mL^-1）。特别是，PMMEFA成功用于同时分析不同生物基质中的CTSs活性，包括4种人类OS细胞系（143 B、MG 63、U2OS和Saos-2）的细胞培养基和细胞裂解物、143 B肿瘤小鼠的血清以及143 B OS的组织匀浆液，证明了其良好的实用性。

引言

组织蛋白酶（CTSs）是一类溶酶体蛋白水解酶，根据其催化位点上被水解肽键的不同氨基酸残基，可分为丝氨酸CTSs（A和G）、天冬氨酸CTSs（D和E）和半胱氨酸CTSs（B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W）[1]、[2]。在正常生理条件下，CTSs参与免疫反应机制中的抗原处理，降解各种蛋白酶和趋化因子，从而维持细胞内稳态[3]、[4]、[5]。在病理条件下，CTSs参与多种恶性肿瘤（尤其是骨肉瘤（OS）、乳腺癌、肺癌、结直肠癌和肝癌）的生长、侵袭、血管生成和治疗抵抗[2]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。例如，多项研究表明OS的转移与多种CTSs（特别是CTS B、D、G、K和L）的过度表达密切相关[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。CTSs的高表达水平通常与恶性肿瘤的强烈侵袭性、转移能力、不良预后和较短生存时间相关。

目前，已开发出多种方法来检测不同样本中CTSs的含量和/或活性，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[16]、酶谱分析[17]、表面等离子共振（SPR）方法[18]、FRET[19]和电化学生物传感器[20]。例如，Song等人使用铁烯标记的肽底物功能化金电极直接检测人血清中的CTS B[20]。尽管这些技术在检测单个CTS的活性/浓度方面表现出高灵敏度和准确性，但同时检测多种CTS仍具有挑战性。由于CTSs在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中表现出协同效应[5]，因此开发高度敏感和选择性的分析技术对于同时识别多种组织蛋白酶的活性至关重要。

肽微阵列技术具有并行处理能力、微型化、高通量筛选和样品消耗量小的优点[21]、[22]，可以通过肽底物与酶之间的特异性识别反应同时分析多种酶的活性[23]。因此，基于肽微阵列的检测方法已广泛应用于多种酶活性的检测，包括蛋白酶[24]、磷酸酶[25]和脱酰酶[27]。例如，Moreno等人开发了羟胺修饰的组蛋白肽微阵列，用于灵敏检测四种I类组蛋白脱乙酰酶同工酶[27]。这些应用突显了肽微阵列技术在推进酶活性分析和功能研究方面的巨大潜力。

本文开发了一种基于肽微阵列的金属增强荧光（MEF）检测方法（PMMEFA），通过将含有FRET对（供体FAM和受体Dabcyl）的CTS肽底物固定在聚（缩水甘油甲基丙烯酸酯-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯）（P(GMA-HEMA）包覆的金纳米棒（GNRs）修饰的显微镜载玻片（GNR@P(GMA-HEMA)）上来同时分析5种CTSs（CTS B、D、G、K和L）的活性。以OS为典型模型，所提出的PMMEFA可用于多种生物基质中5种CTSs的活性测定，包括标准缓冲液、细胞裂解物、细胞培养基、血清和肿瘤组织匀浆液。实验结果表明，CTS的活性与OS的侵袭性和发展显著相关。

部分内容

化学物质和材料

组织蛋白酶B（CTS B）、组织蛋白酶D（CTS D）和组织蛋白酶L（CTS L）购自R&D Systems Ltd.（美国明尼阿波利斯）。组织蛋白酶G（CTS G）和组织蛋白酶K（CTS K）购自Sigma-Aldrich Chemical Ltd.（美国密苏里州圣路易斯）。FRET肽（命名为pep-0、pep-B、pep-D、pep-G、pep-K和pep-L）由Synpeptide Ltd.（中国上海）合成，FRET肽的序列详见表S1。其他试剂和材料的详细信息见支持文件

纯CTSs活性的分析

图1展示了PMMEFA同时检测不同生物样本（包括标准缓冲液、细胞培养基、细胞裂解物、血清和组织匀浆液）中多种CTSs活性的原理。GNR@P(GMA-HEMA)的制备方法基于先前的报道[24]。简要来说，GNR的自组装层通过氨基与金原子之间的配位键形成在氨基硅烷修饰的显微镜载玻片表面。

结论

总之，本文开发了一种基于肽微阵列的MEF检测方法（PMMEFA），通过将FRET肽底物固定在P(GMA-HEMA)包覆的GNR修饰的显微镜载玻片上来同时测定不同基质中的多种CTSs活性。利用GNR的MEF效率、P(GMA-HEMA)的高肽负载能力和微阵列的高通量检测能力，所提出的PMMEFA能够有效分析多种CTSs的活性

CRediT作者贡献声明

李莎莎：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、数据分析。张婉玉：验证。李振生南：验证。王振鑫：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢吉林省科学技术发展计划项目（项目编号：SKL202302030）的支持。