现代医学和生物研究不断需要高度敏感和特异性的分析工具，以便进行准确的诊断和监测。在这方面，生物传感器已成为能够检测多种分析物的变革性工具，包括疾病生物标志物。它们的重要性在于能够提供各种分子的准确定量和定性测定，这在生物和生物医学科学的所有领域都至关重要。
化学发光（CL）就是这样一种工具——它是由化学反应产生的光。这种现象是一种独特的分析工具，因其快速响应、高灵敏度和低背景噪声以及宽线性动态范围而被广泛使用。CL的应用范围非常广泛，包括法医学[1]（使用鲁米诺尔检测血液）到观察某些催化反应、蛋白质和DNA [2]、[3]。在生物应用中，CL相比荧光具有许多优势，因为它不需要外部光源，从而确保了低背景信号和设备的简单性[4]。
然而，这种技术在传感器中的应用有一个显著的缺点，即发出的光强度较低[5]。这是由于化学发光的量子产率较低（小于1%），这是由于电子激发能量的衰减过程中辐射途径和非辐射途径之间的竞争所致。
对于生物医学研究来说，特别感兴趣的是检测活细胞中氧化过程产生的超弱光。这种肉眼看不见的光与重要的细胞功能（如线粒体呼吸和细胞分裂）有关[6]、[7]。其产生原因是自由基氧化剂的活性，这些氧化剂的出现可能表明体内发生了某些生物过程。任务是使用外部试剂记录这些自然过程并获得可测量的信号。
已经提出了多种方法来放大化学发光信号，包括使用具有等离子体共振的金属纳米颗粒[8]或基于它们的催化系统[9]。在典型的生物样本中性环境中，鲁米诺尔和其他荧光团的化学发光强度相比碱性条件会急剧下降，这使得检测低浓度的氧化剂变得困难。在这种条件下信号弱的原因在于分子过渡到激发态的概率低以及辐射的量子产率低。
鲁米诺尔在化学发光反应中会发出蓝光，常被用作这些过程的指示试剂[10]。鲁米诺尔分子的化学发光过程可以分为几个连续阶段[11]。在第一阶段，鲁米诺尔分子在碱性环境中脱质子，形成反应性的二阴离子。然后二阴离子与氧化剂相互作用。最后阶段是氧化，生成一个电子激发的产物，当该产物回到基态时会发射一个光子。
辐射过程和非辐射过程之间的比例决定了化学发光的量子产率。反应的效率显著取决于介质的pH值。由于中间反应产物在碱性环境中稳定，因此鲁米诺尔依赖的化学发光的量子产率随着pH值的增加而显著提高[12]。在中性和酸性环境中，不伴随发光的副反应比例增加，这对生理条件pH值约为7.4的生物研究是一个严重的限制[12]。
尽管灵敏度很高，但鲁米诺尔依赖的化学发光并不总是特异性的，因为鲁米诺尔可以与多种氧化剂反应。从这个角度来看，鲁米诺尔不被视为被动检测器，而是一种化学发光试剂，它改变了反应路径，用更强烈的发光过程替代了自然的微弱发光过程[13]。
在生物系统中发现的氧化剂中，次氯酸盐（NaOCl）占有特殊地位。我们的研究特别关注这种化合物，因为次氯酸盐是人体内自然产生的化合物。它是防御系统的重要组成部分，由血液中的粒细胞中的特定酶在炎症区域产生。次氯酸盐在生物系统中的出现与过氧化氢（H2O2）的存在密切相关，其形成必然会导致化学发光。研究表明，化学发光主要是由次氯酸盐与鲁米诺尔的初始反应引起的，而发光的强度进一步通过鲁米诺尔转化产生的H2O2产物的氧化而增强[12]。
为了实现对特定分析物的高灵敏度，通常通过各种催化系统来增强鲁米诺尔依赖的化学发光。这些催化系统可以大致分为三类：（i）由过渡金属（如K?Fe(CN)?、Cu2?和Co3?）[14]、[15]催化的；（ii）纳米颗粒[8]、[16]、[17]、[18]；以及（iii）基于生物的催化剂[19]。这些催化剂在增强与氧气相关的物种（如羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（•O??）和单线态氧（1O?）的生成方面特别有效，这些物种对于将CL物质氧化为荧光团至关重要[20]。
例如，纯过氧化氢与鲁米诺尔的反应较弱，其检测通常依赖于酶或金属离子的催化活性，这些酶或离子有助于生成这些活性自由基[21]。同样，金属离子通常通过其在将稳定前体转化为高活性自由基物种中的催化作用而被检测到，从而显著放大CL信号。
相比之下，我们的方法依赖于次氯酸盐本身的高氧化潜力，因此不需要额外的催化剂来启动反应。通过从系统中排除特定的催化剂（如HRP或过渡金属离子），我们最小化了其他常见氧化剂产生分析信号的可能性，从而确保了传感器对次氯酸钠的特异性。
通过向含有分析物的透明容器中添加荧光团，可以测量CL的各种特性，如光谱和强度[22]。然而，这样的设计不能直接用作传感器。在典型的静态设备中，试剂在检测器前的容器中混合。将化学发光试剂加入分析物中，然后通过光电倍增管（PMT）测量光强度。
标准的化学发光检测通常依赖于微孔板读数器，这是分析化学中静态测量的常见方法。然而，这些系统需要相对较大的样品体积（通常为数十微升），并且由于设备的机械限制，在捕捉快速反应动力学方面存在局限性。在这项研究中，使用了滴液法作为实验模型来展示这种传统静态检测的有效性。这种比较有助于清晰地评估从静态体积到动态微流控格式的转变。微流控系统能够精确控制试剂的相互作用，并显著减少试剂消耗，这对于开发紧凑且高效的传感器至关重要[23]、[24]、[25]。
流动注射法可以减少CL所需的试剂用量，并将反应限制在一个较小的体积内。该方法涉及在微流控芯片中混合分析物和发光材料，微流控芯片是由集成在单个基底上的微尺寸功能元件组成的，用于执行分析的所有阶段[26]。两种流体在T形或Y形接头处相遇，然后流经位于PMT正前方的通道。为了促进几种层流的混合过程，在微流控通道内引入了特殊的微结构，这种设备被称为“微流控混合器”[27]。有许多拓扑结构被广泛用于需要快速和可控混合的不同应用，如脂质体合成和聚合物纳米颗粒的生成。这种紧凑的设计确保了快速混合，从而获得可重复的辐射强度。
本工作的目的是比较两种组织化学发光反应的方法——静态（滴液法）和动态（微流控法）在灵敏度和可重复性方面的差异。我们尝试研究了每种方法中试剂的混合过程，并将混合结果与CL信号强度和测量重复性进行了比较。此外，对这些方法的详细研究有助于更好地理解鲁米诺尔氧化过程中的化学发光机制。
