《Molecular Ecology Resources》：Epigenetic Age Estimation for Hawaiian False Killer Whales (Pseudorca crassidens) in the Absence of ‘Known-Age’ Individuals
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本文提出了一种创新的表观遗传年龄预测方法，通过整合年龄估计不确定性（采用Kratofil等人提出的偏态正态分布）和甲基化测量不确定性（采用二项分布），开发了首个能够输出年龄概率分布的夏威夷伪虎鲸（Pseudorca crassidens）甲基化年龄时钟（MAE=1.70年）。该方法突破了传统模型对"确知年龄"样本的依赖，利用照片识别目录数据，为缺乏确知年龄个体的濒危物种提供了高精度年龄预测新范式。
摘要
表观遗传衰老模型在野生动物研究和管理中具有巨大潜力，但其应用受限于需要大量确知年龄个体进行模型训练。本研究针对夏威夷伪虎鲸这一濒危物种，开发了一种新型甲基化年龄预测方法，创新性地将年龄估计不确定性（通过照片识别目录数据获得）和甲基化测量不确定性纳入模型构建过程。
引言
野生种群年龄估计长期面临挑战。传统方法如生长层计数需要死亡标本，而分子年龄生物标志物（MABs）特别是DNA甲基化分析，为活体动物年龄估计提供了新途径。然而，现有甲基化时钟方法需要70-134个确知年龄样本进行训练，这对许多野生动物种群而言难以实现。
材料与方法
研究选取96个皮肤样本（来自80个个体），基于Cascadia研究集体的照片识别目录数据，采用Kratofil等人开发的协议生成每个个体的年龄概率分布。通过靶向DNA甲基化测序分析8个基因座的184个CpG位点，使用四种机器学习方法（弹性网络回归ENR、支持向量机SVM、随机森林RFR、广义可加模型GAM）进行模型训练。
模型设计与优化
研究系统比较了五种模型设计选择：训练方法、年龄转换方式、CpG位点选择、训练样本集选择及样本加权方案。最佳模型采用SVM方法训练，使用置信评级（CR）4+样本，不进行对数转换，通过ENR逐步调优选择47个信息性CpG位点。
重采样与不确定性整合
创新性地采用重采样方法，从每个样本的年龄概率分布和甲基化二项分布中随机抽取1000个副本，生成预测年龄概率分布而非点估计。该方法首次实现了输入数据不确定性的完整传递。
结果
最终模型的整体中位绝对误差（MAE）为1.70年，预测年龄与Agebest相关性达0.93。模型在不同年龄组表现差异显著：0-9岁组MAE=1.44年，10-24岁组MAE=1.50年，25岁以上组MAE=3.00年。年龄预测概率分布的95%最高密度区间（HDI）覆盖了90%样本的Agebest值，对13对重复样本的年龄顺序预测正确率达85%。
讨论
本研究首次实现了表观遗传年龄预测中不确定性的完整量化传递。与现有方法相比，该模型在样本年龄不确定性较大的情况下仍保持较高精度（MAE=1.70年），优于许多使用确知年龄样本训练的已发表时钟。方法学创新包括：1）使用偏态正态分布表示年龄不确定性；2）用二项分布表示甲基化测量不确定性；3）通过重采样生成预测年龄概率分布。
模型对高龄个体预测精度下降的可能原因包括：高龄样本量不足、年龄估计不确定性随年龄增加而增大、以及甲基化与年龄关系的非线性特征。研究还发现，基于牙齿生长层组（GLG）的年龄估计与模型预测存在差异（平均残差0.85），可能反映了搁浅个体与活体活检样本的生理状态差异。
结论与展望
该方法突破了表观遗传年龄预测对确知年龄样本的依赖，为缺乏准确年龄记录的濒危物种提供了可靠年龄估计工具。通过产生预测年龄概率分布，使研究人员能够准确传达年龄估计的不确定性，支持保护管理决策。未来可扩展应用于其他数据稀缺的濒危物种，推动保护生物学研究从点估计向概率估计的范式转变。
