《Neuroscience Research》：A novel brainstem-targeted G51D α-synuclein fibril-injected mouse model exhibits sequential emergence of sleep and motor dysfunction
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本研究针对α-突触核蛋白（α-syn）病理在突触核蛋白病（如帕金森病）中起源于脑干并序贯传播的Braak假说，以及快速眼动睡眠行为障碍（RBD）作为其前驱标志的临床关联，创新性地将家族性帕金森病相关的G51D突变α-syn纤维微量注射至小鼠脑桥被盖区。研究首次揭示了G51D α-syn纤维相较于野生型（WT）能诱导更广泛的病理传播，并导致RBD样行为、运动缺陷及多巴胺能神经元丢失的时序性出现，为研究突触核蛋白病的发病机制及前驱症状提供了宝贵模型。
在神经退行性疾病的研究版图中，帕金森病（Parkinson’s disease, PD）及其相关的突触核蛋白病（synucleinopathies）占据着重要位置。这类疾病的一个核心病理特征是α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-syn）的异常聚集。临床上，快速眼动睡眠行为障碍（rapid eye movement sleep behavior disorder, RBD）被广泛认为是突触核蛋白病的前驱表现，大多数特发性RBD患者会在10-14年内发展为帕金森病、路易体痴呆或多系统萎缩。根据Braak假说，α-syn病理并非随机发生，而是遵循一个特定的传播序列：通常从肠道神经系统和/或嗅球开始，逐步进展至延髓、脑桥、中脑，最终到达大脑皮层。特别值得注意的是，脑桥被盖区作为调控快速眼动睡眠（REM sleep）的关键脑区，在Braak分期的早期阶段就出现了α-syn病理，这为解释RBD为何是PD的早期征兆提供了潜在的解剖学基础。
然而，尽管Braak假说已被广泛接受，但能够在动物模型中重现这种起源于脑干、并序贯传播的病理进程的研究工具却十分有限。传统的帕金森病模型，如使用神经毒素（6-OHDA, MPTP）或通过腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）在黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）过表达α-syn，虽然能模拟部分运动症状，但往往无法再现从脑桥起源的病理传播过程，也鲜有报道能表现出RBD样表型。近年来，有研究尝试将野生型（wild-type, WT）α-syn的预形成纤维（preformed fibrils, PFFs）注射到调控REM睡眠的关键核团——下背外侧被盖区（sublaterodorsal tegmentum, SubLDT），成功诱导出了RBD样行为，这为构建更贴近人类疾病进程的模型提供了新思路。但使用WT α-syn可能限制了模型模拟疾病中实际的病理传播能力和临床严重性的能力。
本研究将目光投向了α-syn的G51D突变。这是一种与家族性帕金森病相关的基因变异，其导致的疾病具有发病早、进展快、临床症状重（包括自主神经功能障碍）等特点，并且临床上在G51D突变患者中确实观察到了RBD症状。体外研究表明，G51D突变会促进α-syn纤维的形成和磷酸化（pS129）包涵体的产生。那么，将具有更强毒性和传播潜力的G51D突变型α-syn纤维直接导入脑桥REM睡眠调控核心区，会引发怎样的病理进程和临床表现呢？这成为了本研究试图解答的核心科学问题。
研究人员巧妙地设计了实验方案。他们将G51D α-syn PFFs、WT α-syn PFFs或生理盐水（作为对照）微量注射到C57BL/6J小鼠脑桥的SubLDT及周边区域。为了全面评估模型的表现，他们在注射后第4周（4 W）、12周（12 W）和20周（20 W）这三个时间点，分别对小鼠进行了长达24小时的脑电图（electroencephalogram, EEG）和肌电图（electromyogram, EMG）记录，以精细分析其睡眠-觉醒结构的变化。同时，他们还通过旷场实验（open field test, OFT）和旋转棒测试（rotarod test）来评估小鼠的焦虑样行为和运动协调能力。在实验终点（20 W），通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）技术检测了磷酸化α-syn（pS129-α-syn）在多个脑区（包括注射部位SubLDT、邻近的背外侧被盖核（laterodorsal tegmental nucleus, LDTg）、黑质致密部（SNc）、腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）、嗅周皮层（ectorhinal cortex, EC）以及腹侧延髓（ventral medulla, vM）的沉积情况，并分析了SNc和VTA中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性的多巴胺能神经元的存活情况。此外，还通过单侧注射实验，进一步观察了病理蛋白在脑内的传播范围。
本研究主要运用了以下关键技术方法：通过立体定位注射技术将体外制备的G51D或WT α-syn PFFs精准导入小鼠脑桥特定核团；利用长期植入的EEG/EMG电极进行多时间点的睡眠监测和状态分析，并特别定义了REM睡眠期无肌张力缺失（REMS without atonia, RWA）作为RBD样表型的指标；通过旷场实验和旋转棒测试进行行为学表型分析；采用免疫组织化学方法对脑组织切片进行pS129-α-syn和TH等标志物的染色，并通过图像分析软件进行定量评估。
睡眠表型分析结果
对睡眠结构的分析发现，尽管WT α-syn纤维组在20 W时表现出觉醒轻度增加而非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement sleep, NREMS）相应减少的趋势，G51D组在4 W时REM睡眠发作次数增多，但各组在总睡眠时间、发作次数和平均持续时间上总体变化不大。然而，在分析REM睡眠期间的肌电活动时，研究取得了关键发现。他们将肌电信号强度超过之前NREMS阶段的REM睡眠时段定义为RWA。结果显示，在注射后4 W，G51D α-syn纤维组小鼠表现出RWA的REM睡眠发作百分比显著高于生理盐水对照组。这表明在疾病模拟的早期阶段，小鼠就出现了类似人类RBD的病理生理特征。值得注意的是，这种RWA表型在12 W和20 W时变得不显著。
行为学结果
在行为学测试中，旷场实验未显示各组小鼠在焦虑样行为（以在中心区域停留时间为指标）或自发活动总距离上存在差异。然而，在评估运动协调能力的旋转棒测试中，G51D α-syn纤维组小鼠在注射后12 W从旋转棒上跌落的时间（潜伏期）显著短于盐水对照组，提示其出现了运动功能障碍。而这一运动缺陷在20 W时也变得不显著。
病理学结果
在实验终点（20 W）进行的组织学分析揭示了深刻的病理变化。免疫染色显示，在注射部位SubLDT及其相邻的LDTg，G51D α-syn纤维组小鼠的pS129-α-syn阳性信号面积显著高于WT纤维组和盐水组。更重要的是，病理改变并不仅限于注射局部。在距离注射点较远的脑区，包括中脑的SNc和VTA，以及新皮层的EC和延髓的vM，都观察到了pS129-α-syn的沉积。特别是在vM，G51D组同侧的信号积累显著高于WT组，表明G51D突变体具有更强的病理传播能力。对多巴胺能神经元的定量分析发现，G51D α-syn纤维组小鼠VTA区域内TH与Nissl双阳性细胞（即存活的多巴胺能神经元）的比例相较于WT纤维组显著降低，SNc也呈现相似趋势，尽管未达到统计学显著性。这提示G51D α-syn纤维从脑桥注射部位传播出去，并对中脑多巴胺能系统产生了毒性作用。
本研究成功建立了一个新型的、具有高度病理和临床相关性的小鼠模型。该模型的核心发现在于，向脑桥REM睡眠关键调控区注射G51D突变型α-syn纤维，能够诱导出时序性出现的疾病表型：首先是在注射后4周出现RBD样的REM睡眠期肌张力缺失（RWA），随后在12周出现运动功能障碍，并在20周时观察到广泛的α-syn病理沉积（pS129-α-syn）以及中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的丢失。这种“睡眠障碍先行，运动症状后继”的疾病进程，很好地模拟了人类帕金森病中非运动症状早于典型运动症状出现的临床规律，为Braak假说中关于病理从脑干起源并向上传播的观点提供了有力的实验证据。
研究的意义是多方面的。首先，它证实了G51D突变相较于WT α-syn确实具有更强的病理诱导和传播能力，这可能与G51D纤维独特的结构特性、增强的种子活性以及更高的细胞毒性有关。其次，该模型首次在单一生理系统中再现了从RBD前驱表型到帕金森样运动障碍的序贯发展过程，为深入研究突触核蛋白病发病早期，病理蛋白如何沿着特定神经环路传播并导致不同阶段临床症状的细胞和分子机制提供了极其宝贵的平台。例如，RBD样表型可能与SubLDT内表达促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白（corticotropin-releasing hormone–binding protein, CRHBP）的谷氨酸能神经元受损有关，而这些神经元有投射至vM调控REM睡眠期肌张力。而运动障碍则可能与病理传播至中脑多巴胺系统有关。研究也讨论了模型中RWA和运动缺陷表型在后期不显著的可能原因，如神经补偿机制的出现，这甚至可能与临床观察到的“RBD逆转”亚型有相似之处，为理解疾病异质性提供了线索。
当然，模型也存在一些局限性，例如表型的 transient（短暂性）特性、未评估病理沉积的蛋白酶K抗性以完全确认其病理性聚集属性等，这些都为未来研究指明了方向。总而言之，这项由Yu Hayashi和Shinnosuke Yasugaki等人完成的研究，通过精巧的实验模型构建，为理解突触核蛋白病的起源和 progression（进展）机制迈出了重要一步，对开发针对疾病早期阶段的干预策略具有重要的启示意义。该研究成果已发表在《Neuroscience Research》期刊上。
