《Neurotherapeutics》：Small molecule JRMS modulating importin-β1 chaperone activity as a therapeutic strategy reducing TDP-43 pathology
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本研究针对肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)中TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)异常聚集这一核心病理特征，开发了能够增强核输入受体importin-β1(KPNB1)分子伴侣活性的小分子化合物JRMS。研究发现JRMS通过增加KPNB1的胞质可用性，有效减少多种TDP-43变异体的胞质聚集并促进其核定位，在细胞系、原代神经元、iPSC来源皮质神经元、脑片组织和动物模型中均证实其疗效，且不引起细胞毒性或影响基础核质运输功能。该研究为TDP-43蛋白病变相关神经退行性疾病提供了新的治疗策略。
在神经退行性疾病研究领域，一个名为TDP-43的蛋白质近年来引起了科学家的高度关注。这个通常存在于细胞核内的RNA结合蛋白，在肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)患者的大脑中出现了异常行为——它们错误地聚集在神经细胞的细胞质中，形成不溶性包涵体，同时细胞核内的TDP-43却显著减少。这种"核内缺失、胞质聚集"的现象被认为是驱动神经退行性变的关键病理机制。
TDP-43病理不仅存在于ALS和FTD，还在肢端 predominant 年龄相关TDP-43脑病(LATE)以及高达57%的阿尔茨海默病病例中被发现，与加速的认知衰退密切相关。因此，寻找能够逆转TDP-43异常聚集的治疗策略，成为神经科学领域的重要挑战。
正常情况下，TDP-43在细胞核和细胞质之间穿梭，发挥调控RNA代谢的关键功能。然而，在疾病状态下，多种因素可能导致TDP-43在细胞质中发生异常相变和聚集。更严重的是，这些胞质聚集体会像"陷阱"一样捕获新合成的或正在穿梭的TDP-43，阻止其进入细胞核，从而形成恶性循环。同时，聚集物还会扣押核质运输(NCT)机制的关键组分，进一步加剧TDP-43的核内缺失和胞质聚集。
面对这一难题，多伦多大学Tanz神经退行性疾病研究中心的Marc Shenouda、Janice Robertson等研究人员将目光投向了一个看似不相关的蛋白质——importin-β1(KPNB1)。KPNB1是经典的核输入受体，负责将带有核定位信号(NLS)的蛋白质转运入核。但近年研究发现，KPNB1还具有分子伴侣功能，能够防止和逆转异常蛋白聚集。增加KPNB1表达可以溶解TDP-43聚集物并恢复其核定位，这使其成为治疗TDP-43蛋白病变的理想靶点。
研究人员在《Neurotherapeutics》上发表的研究中，鉴定并验证了一个名为JRMS的小分子化合物，它能够通过增强KPNB1的分子伴侣活性，成为对抗TDP-43病理的有力武器。
关键技术方法包括：利用表达EGFP标记的TDP-43变异体(包括TDP-43ΔNLS、TDP-25、TDP-35和sTDP-43)的细胞模型；在原代小鼠皮质神经元和人iPSC来源皮质神经元中建立TDP-25聚集模型；通过免疫共沉淀验证KPNB1与TDP-25的相互作用；使用AAV9-EGFP-TDP-25构建的小鼠体内模型；建立器官型脑切片进行实时成像分析；采用免疫荧光、免疫印迹和免疫组化等多种技术评估蛋白聚集和定位。
JRMS防止/逆转细胞和神经元中TDP-43变异体的聚集
研究人员首先在HeLa细胞中表达了四种不同的TDP-43变异体：全长TDP-43、核定位信号突变的TDP-43ΔNLS，以及病理相关的截短变体TDP-35、TDP-25和sTDP-43。所有变异体均形成胞质聚集物。用15μM JRMS处理90分钟后，TDP-43ΔNLS的聚集细胞数减少57%，TDP-35减少34%，TDP-25减少45%，sTDP-43减少65%。JRMS还显著增强了TDP-35和sTDP-43的核定位。
选择TDP-25进行深入研究，因为其聚集物具有异常磷酸化(pS409/410)、泛素化和p62标记的特征，更好地模拟了疾病中的TDP-43病理。JRMS不仅减少了TDP-25聚集物的数量，还显著减小了残留聚集物的体积。生化分级分离显示，JRMS使不溶性TDP-25水平降低约55%。急性和慢性处理均呈现剂量依赖性的聚集减少效果。
在原代小鼠皮质神经元中，JRMS在浓度高达30μM时未显示神经毒性。15μM JRMS处理90分钟使TDP-25聚集物的数量和大小均减少约45%。免疫印迹显示JRMS降低了磷酸化TDP-25水平，但不影响总TDP-25或KPNB1水平，表明其作用特异针对聚集而非蛋白丰度。在人iPSC来源皮质神经元中，7.5μM JRMS处理使TDP-25聚集物减少47%。
JRMS对TDP-43的防止/逆转作用依赖于KPNB1
JRMS与KPNB1的331-361位氨基酸结合，该区域与RanGTP和importin-α的结合位点重叠。研究发现，KPNB1水平调节TDP-25聚集：siRNA敲低KPNB1增加磷酸化TDP-25水平，而过表达KPNB1则减少TDP-25磷酸化和聚集。JRMS减少TDP-25聚集的作用在KPNB1敲低细胞中被消除，证明其效果依赖于KPNB1。
免疫荧光显示JRMS增加了KPNB1的胞质池。免疫共沉淀证实KPNB1与TDP-25存在相互作用。值得注意的是，JRMS处理后与KPNB1共沉淀的总TDP-25减少，同时磷酸化TDP-25水平降低，表明KPNB1主要与聚集形式的TDP-25相互作用。当标准化为磷酸化TDP-25水平时，JRMS处理显示KPNB1与磷酸化(聚集)TDP-25的相对相互作用增加。
JRMS处理不影响内源性TDP-43或核质运输报告基因NLS-tdTomato-NES的核质定位，也不影响RanGAP1或KPNA2的定位，表明JRMS不损害基础核质运输功能。
JRMS在体内和器官型脑切片中减少TDP-25聚集
在TDP-25小鼠模型中，新生小鼠通过脑室内注射AAV9-EGFP-TDP-25，在3周龄时形成神经元胞质TDP-25聚集物。绕过血脑屏障，通过脑室内注射给予JRMS(3μl的190μM溶液)，每周三次，持续两周。免疫组化分析显示，JRMS处理减少了TDP-25聚集物的大小和丰度，生化分析显示磷酸化、聚集的TDP-25水平降低35%。NeuN染色和神经元计数显示无神经毒性。机制上，JRMS处理增加了神经元中KPNB1的胞质池。
在器官型脑切片实验中，来自10日龄TDP-25小鼠的脑切片每2天用JRMS或DMSO处理1周。活细胞成像显示，DMSO处理的切片中神经元TDP-25聚集物增加，而JRMS处理的切片在同一时间段内聚集负担降低至基线以下。
研究结论与意义
本研究首次报道了小分子化合物JRMS通过调控importin-β1(KPNB1)的分子伴侣活性，有效减轻TDP-43病理的创新治疗策略。JRMS通过增加KPNB1的胞质可用性，增强其与聚集TDP-43的结合能力，从而溶解已形成的聚集物并防止新聚集物的形成。
这一策略的创新性在于巧妙利用了细胞内已有的蛋白质量控制机制，而非引入外源性成分。JRMS不影响基础核质运输功能，且在多种实验系统(细胞系、原代神经元、人iPSC来源神经元、脑切片和活体动物)中均显示一致效果，证明了其作用机制的普适性和可靠性。
值得注意的是，JRMS对多种TDP-43变异体(包括缺乏核定位信号的变体)均有效，表明KPNB1可能通过与其聚集倾向区域(特别是低复杂度结构域)的多价弱相互作用发挥分子伴侣功能，而不完全依赖于经典的核定位信号识别。
该研究为TDP-43蛋白病变相关疾病(如ALS、FTD、LATE以及伴有TDP-43共病理的阿尔茨海默病)提供了新的治疗方向。鉴于KPNB1和相关核输入受体已被证明对多种RNA结合蛋白具有通用解聚功能，JRMS可能对更广泛的聚集驱动疾病具有治疗潜力。未来的研究将需要进一步优化JRMS的药代动力学特性，特别是其血脑屏障通透性，并评估其在更长期的疾病模型中的疗效和安全性。
