《Photodiagnosis and Photodynamic Therapy》：Hemoporfin photodynamic therapy affects secretion, uptake, and function of human umbilical vein endothelial cell-derived exosomes via apoptosis and autophagy
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本研究针对HMME-PDT治疗鲜红斑痣过程中外泌体介导的抗血管机制不明确的问题，通过分析HUVEC来源外泌体的分泌、摄取及功能，发现HMME-PDT通过凋亡与自噬途径显著增强外泌体分泌与摄取能力，并证实外泌体可携带HMME photosensitizer抑制受体细胞增殖、促进凋亡与自噬。该研究为工程化外泌体作为光敏剂递送平台提供了新策略，对提升HMME-PDT临床疗效具有重要意义。
鲜红斑痣（Port-Wine Stains, PWS）作为一种先天性的毛细血管畸形，虽属良性病变，却会随年龄增长出现色泽加深、皮肤增厚甚至结节样改变，给患者带来严重的心理负担。脉冲染料激光（Pulsed Dye Laser, PDL）虽是当前临床治疗PWS的金标准，但疗效存在显著的个体差异。近年来，血卟啉单甲醚光动力疗法（Hemoporfin Photodynamic Therapy, HMME-PDT）因其稳定的光化学特性和较低的光毒性，已成为我国治疗PWS的重要选择。其作用机制是通过532nm激光激活光敏剂HMME，产生单线态氧等活性氧物质，选择性破坏畸形血管。但HMME-PDT如何通过细胞间通讯影响血管内皮细胞的功能，尤其是外泌体（exosomes）在这一过程中扮演的角色，尚不明确。
外泌体作为直径30-100纳米的细胞外囊泡，可通过携带蛋白质、microRNA等生物活性物质参与细胞间信息传递。近年研究发现，肿瘤细胞在PDT作用下会大量释放外泌体，但血管内皮细胞来源的外泌体在HMME-PDT中的行为机制仍是空白。为此，清华大学临床医学院附属北京清华长庚医院皮肤科团队在《Photodiagnosis and Photodynamic Therapy》发表研究，首次揭示了HMME-PDT通过凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）双向调控人脐静脉内皮细胞（HUVECs）外泌体分泌、摄取及功能的分子网络。
研究团队通过透射电镜和蛋白质印迹法（Western blot）鉴定了HUVEC来源外泌体的典型形态与标志蛋白（CD63、CD81）。利用BCA蛋白定量、乙酰胆碱酯酶活性检测及PKH26荧光标记实验，发现HMME-PDT处理后外泌体分泌量增加2.5倍，且受体细胞对其摄取效率显著提升。值得注意的是，自噬抑制剂3-MA（3-Methyladenine）可抑制外泌体分泌，而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK则产生相反效应，表明凋亡与自噬在外泌体调控中存在拮抗作用。
更引人注目的是，研究首次证实外泌体可携带HMME光敏剂。通过紫外分光光度法检测，HMME-PDT组外泌体中HMME浓度较对照组升高3.2倍，且该过程受自噬正向调控、受凋亡负向调控。功能实验显示，经HMME-PDT处理细胞来源的外泌体可显著抑制受体HUVEC增殖（CCK-8法验证），并通过上调Cleaved Caspase 3、Cytochrome C等蛋白诱导凋亡；同时借助mRFP-GFP-LC3双荧光标记系统观察到自噬流（autophagic flux）增强，表现为自噬体（黄色斑点）与自噬溶酶体（红色斑点）数量增加。
关键技术方法包括：通过磷脂酰丝氨酸亲和磁珠法高纯度提取外泌体；采用TUNEL染色与Western blot分析凋亡水平；利用双荧光LC3转染系统实时监测自噬流；通过体外共培养模型评估外泌体对受体细胞功能的影响。
3.1 外泌体表征
电镜显示外泌体呈典型双凹盘状结构，Western blot验证CD63/CD81阳性而Calnexin阴性，符合外泌体特征。
3.2 凋亡与自噬调控外泌体分泌与摄取
BCA与乙酰胆碱酯酶检测表明，HMME-PDT通过自噬促进外泌体分泌，而凋亡起抑制作用；荧光示踪实验进一步证实自噬增强外泌体被受体细胞内化。
3.3 外泌体介导HMME转运
光谱分析显示自噬可提升外泌体HMME载量，凋亡则降低其携带效率，提示自噬有助于光敏剂的外泌体包载。
3.4 外泌体功能受凋亡/自噬调控
HMME-PDT来源的外泌体通过递送活性物质抑制细胞增殖、促进凋亡/自噬，且自噬可拮抗凋亡的细胞毒性作用，形成双向调控网络。
讨论部分指出，HMME-PDT通过氧化应激同步激活凋亡与自噬通路，而外泌体成为二者交叉对话的关键媒介。自噬促进外泌体分泌及HMME装载，可能是一种细胞应激保护机制；而凋亡主导的外泌体功能变化则加剧细胞死亡。该研究不仅阐明了HMME-PDT的新型抗血管机制，更开创性地提出工程化外泌体作为光敏剂靶向递送系统的潜力，为优化PWS临床治疗方案提供了理论依据。
