《Placenta》：Exploring placental ultrastructure: A review of electron microscopy techniques and emerging methods for resolving 3D organelle architecture.
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胎盘滋养层细胞超微结构研究历经70年电子显微镜技术革新，重点探讨体积电子显微镜（SBF-SEM、array tomography）与冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）在解析线粒体形态学演变及胎盘功能关联中的应用。技术突破包括3D重构、低温样本制备及多尺度成像，为揭示细胞器结构与胎盘发育的分子机制提供新范式。
西达尔特·阿查里亚（Siddharth Acharya）|埃里克·汉森（Eric Hanssen）|詹姆斯·C·鲍威尔（James C. Bouwer）|约翰·E·施詹肯（John E. Schjenken）|柯尔斯蒂·G·普林格尔（Kirsty G. Pringle）|罗杰·史密斯（Roger Smith）|约书亚·J·费舍尔（Joshua J. Fisher）
澳大利亚新南威尔士州新兰姆顿海茨（New Lambton Heights）亨特医学研究所（Hunter Medical Research Institute）的生殖与家庭健康项目（Reproductive and Family Health Program）
摘要 滋养层细胞覆盖在胎盘绒毛的表面，促进了母体和胎儿血液循环之间的营养物质、气体和废物的交换。细胞滋养层（CTB）细胞与周围的多核合胞滋养层（STB）细胞融合过程中，细胞超微结构（亚细胞结构）会发生改变。滋养层分化后，线粒体的大小显著减小，形态也发生改变，因此由于它们在胎盘发育中产生能量方面起着关键作用，成为研究的重点。观察这种结构变化依赖于电子显微镜技术，该技术为理解线粒体的功能提供了重要线索。自20世纪50年代首次使用电子显微镜研究绒毛滋养层以来，出现了新的技术，能够以前所未有的分辨率观察胎盘的超微结构。本文综述了过去70年中用于研究胎盘的电子显微镜技术的发展。此外，我们还讨论了用于解析胎盘内三维细胞器结构的新方法，这些方法为复杂组织提供了更具生理学意义的信息和背景。进一步地，我们探讨了先进的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术，该技术为研究人类胎盘中线粒体结构与蛋白质结构之间的复杂关系提供了重要机会。通过专门关注线粒体成像，我们展示了体积电子显微镜和冷冻电子断层扫描技术在揭示细胞器在胎盘发育中的作用方面的能力。
引言 滋养层细胞覆盖在胎盘绒毛的表面，促进了胎盘植入、母体与胎儿之间的营养物质交换以及类固醇的生成[1]、[2]、[3]。为了完成这些功能，滋养层依赖于其细胞超微结构（亚细胞结构）[4]。在基底膜旁边，前体上皮细胞——增殖性的细胞滋养层（CTB）融合并分化为外层的多核合胞滋养层（STB）。分化后，细胞超微结构重新组织，细胞器也经历结构重塑以适应新的细胞功能[4]、[5]、[6]、[7]。自20世纪50年代首次使用电子显微镜研究绒毛滋养层以来，出现了许多新技术，这些技术加深了我们对胎盘超微结构的理解，有助于更全面地了解胎盘的功能。
研究胎盘的超微结构需要分辨小于光波波长（400-650纳米）的亚细胞特征，这使得光学显微镜技术无法胜任。由于电子的波长比光波小10万倍，电子显微镜通过发射聚焦的电子束来观察细胞超微结构[8]、[9]。电子通过热电子发射（加热钨丝）或场发射（对钨尖端施加强电场）[10]、[11]产生。随后，电子被电磁聚光镜和光圈加速和聚焦，再通过物镜成像。根据电子与组织的相互作用方式，电子显微镜可分为两大类：透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
在透射电子显微镜（TEM）中，电子穿过薄层组织（通常通过超薄切片机切成约100纳米），电子可能直接穿过组织，或者发生弹性散射（产生背散射电子）或非弹性散射（能量传递给样品中的原子，产生二次电子）[12]。透射电子和散射电子被收集起来形成图像，提供关于样品的高分辨率信息。在扫描电子显微镜（SEM）中，电子聚焦在样品表面，发生弹性散射或非弹性散射。背散射电子提供样品成分的信息，因为较重的元素散射更强，因此显得更亮；而二次电子则提供样品表面形态的信息[13]。在TEM和SEM中，电子束都在真空中操作，以避免电子与空气颗粒的碰撞，因此生物样品必须经过固定、脱水、包埋在树脂中并切片，然后浸渍重金属以增强生物特征的对比度（图1A）。虽然标准TEM只能生成二维图像，但可以通过多种倾斜角度对样品进行成像，从而生成三维重建图像，尽管其分辨率低于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）[14]。使用扫描电子显微镜（SEM），可以通过一系列称为“体积电子显微镜”的技术对样品进行连续成像，以解析样品的三维超微结构（图1B）[15]。
冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术由于自动化和软件的简化，在过去十年中变得更加普及，能够达到接近原子级别的分辨率（<10 ?），可以观察细胞超微结构、孤立的细胞器或纯化的蛋白质（图1C）[16]。与使用化学固定和脱水的标准TEM和SEM不同，冷冻电子断层扫描在成像过程中使用低温，并采用玻璃化处理的样品[16]。玻璃化处理无需脱水即可保留生物样品的天然分子结构，从而保持生理结构。在低温下成像还能减少电子束造成的损伤，允许从多个倾斜角度（通常±60°）收集多张显微照片，用于进行三维重建[17]。此外，在冷冻条件下，在使用冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）观察之前，可以使用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）对样品进行薄切片，从而获得最佳的信噪比和对比度，以便原位确定蛋白质结构[18]。冷冻电子断层扫描技术的出现为胎盘研究领域提供了前所未有的机会，可以以极高的分辨率观察滋养层细胞器。这些发现将大大增进我们对细胞器结构、蛋白质结构与胎盘功能之间关系的理解。
本文将回顾过去70年来电子显微镜技术的进步及其在胎盘超微结构研究中的应用，特别关注线粒体和其他亚细胞器的成像。通过对线粒体的成像和研究，我们可以了解滋养层分化过程中的形态变化，而这些方法也可应用于所有亚细胞结构和细胞器。因此，我们强调了揭示目前尚不清楚的调节分化和胎盘功能的亚细胞过程的巨大潜力。为此，我们讨论了新兴的三维电子显微镜技术，并指出了当前从成像数据中提取生物信息方面的局限性。
电子显微镜早期在绒毛滋养层研究中的应用 自20世纪50年代以来，人们就开始研究滋养层超微结构，尤其是前体CTB和分化后的STB中的细胞器形态[19]、[20]、[21]，最初是由Wislocki和Dempsey观察到CTB与STB之间的形态差异[19]、[20]、[21]。Boyd和Hughes在1954年的开创性研究中，通过透射电子显微镜（TEM）观察了固定的胎盘绒毛切片，发现STB的细胞质颜色更深，细胞核更为不规则（图…）
应对挑战与局限性 尽管三维电子显微镜技术在理解细胞器结构和功能方面具有潜力，但仍存在一些需要解决的挑战和局限性。许多机构难以获得样品制备设备和电子显微镜，尤其是冷冻电子断层扫描所需的玻璃化设备和高分辨率显微镜。由于高昂的购置和维护成本，这些设备的使用仍然受到限制
未来展望与结论 尽管胎盘在支持胎儿发育中起着关键作用，但由于其极高的复杂性和CTB融合后的广泛超微结构重塑，滋养层双层结构仍是人类组织中了解最少的部分之一。体积电子显微镜技术（如SBF-SEM和阵列断层扫描）的应用促进了胎盘研究的发展，这些技术能够以精细的背景信息解析细胞器的三维结构
CRediT作者贡献声明 罗杰·史密斯（Roger Smith）： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、资金筹集、概念构思。约书亚·J·费舍尔（Joshua J. Fisher）： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、资金筹集、概念构思。柯尔斯蒂·G·普林格尔（Kirsty G. Pringle）： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、概念构思。詹姆斯·C·鲍威尔（James C. Bouwer）： 撰写——审稿与编辑、方法论设计、概念构思。约翰·E·施詹肯（John E. Schjenken）： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、概念构思。西达尔特·阿查里亚（Siddharth Acharya）：
伦理批准 本研究的伦理批准获得了纽卡斯尔大学研究伦理委员会（H-382-0602）、亨特新英格兰健康人类研究伦理委员会（02/06/12/.13）、Mercy Health人类研究伦理委员会（R11/34）以及特定站点评估（SSA/15/HNE/291）的批准，符合赫尔辛基宣言的标准。在获得书面同意的情况下，从健康足月妊娠（38-40周）的孕妇中收集了用于SBF-SEM、阵列断层扫描和FIB磨制的胎盘样本
作者声明本研究过程中不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
我们要感谢Boyin Liu博士在FIB-SEM技术辅助下制备胎盘切片方面的帮助。同时，我们也感谢约翰亨特医院（John Hunter Hospital）和Mercy妇女医院（Mercy Hospital）的研究助产士和临床工作人员，以及为这项研究捐赠胎盘的孕妇。图示图形使用
BioRender.com 工具制作。
