《Plant Physiology and Biochemistry》：Biosynthesis of Volatile Sesquiterpenoid Active Components in
Nekemias grossedentata (Vine Tea) roots
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本研究针对藤茶（Nekemias grossedentata）挥发性倍半萜生物合成途径不明确的科学问题，通过整合代谢组、转录组与功能基因组学，系统鉴定了84个萜类合酶基因，发现其家族扩张主要由串联重复驱动；功能验证揭示10个NgTPS酶可催化合成23种倍半萜，并在高产酵母底盘EPY300中实现de novo合成（摇瓶产量3.00–21.51 mg·L-1）。该研究首次阐明藤茶根部特异性积累倍半萜的分子机制，为风味改良和微生物高效生产高值萜类提供了关键基因资源与技术策略。
藤茶（Nekemias grossedentata）作为一种药食同源植物，其叶片因富含黄酮类成分而备受关注，但对其香气贡献显著的挥发性萜类成分的生物合成机制却鲜有研究。尤其令人困惑的是，尽管叶片是主要食用部位，代谢组学数据却显示倍半萜类化合物在根部特异性富集，这一现象背后的代谢调控网络和生态适应意义尚属未知。厘清藤茶挥发性活性成分的生物合成路径，不仅关乎其风味品质提升，更对开发新型天然香料、药物先导化合物具有重要意义。
为系统解析这一科学问题，研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表论文，开展了一项整合多组学与合成生物学的系统性研究。研究人员首先通过顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）技术分析了藤茶根、成熟叶、嫩叶和顶芽四种组织的挥发性有机物（VOCs），发现根部倍半萜含量显著高于地上部。转录组分析进一步表明，甲羟戊酸途径（MVA）基因在根部特异性高表达，暗示其为倍半萜前体法尼基焦磷酸（FPP）的主要来源。
研究的关键技术方法包括：基于HS-SPME-GC-MS的代谢组学分析、转录组测序与差异表达分析、全基因组范围内萜类合酶（TPS）基因家族的鉴定与进化分析、酵母（EPY300菌株）和大肠杆菌异源表达系统进行酶功能验证、以及利用工程酵母进行de novo倍半萜合成的时间动力学测定。样本来源于中国科学院武汉植物园栽培的三年生藤茶植株。
3.1. 藤茶挥发性代谢物谱的GC-MS分析
通过代谢组学分析，研究在四种组织中共鉴定出1804种挥发性化合物，其中萜类占比最高（21.85%）。主成分分析（PCA）显示根与三种地上部组织代谢谱显著分离。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）和维恩分析进一步鉴定出1160个差异积累代谢物（DAMs），其中倍半萜（占萜类DAMs的70.54%）在根部特异性富集，如Bicyclogermacrene、(E)-α-佛手柑烯等。
3.2. 藤茶萜类骨架合成基因的鉴定
研究鉴定了MVA和MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径的关键酶基因。表达谱分析显示，MVA途径多个基因（如AACT1/2、HMGS1/2、HMGR1/2）在根部高表达，而MEP途径基因的表达无此偏好性，表明根部倍半萜合成主要依赖MVA途径提供前体。
3.3. NgTPS基因的鉴定与特征分析
基因组共鉴定出84个NgTPS基因，其中TPS-a亚家族最大（46个成员）。进化树将其分为TPS-a至TPS-g五个分支。染色体定位显示基因分布不均，以1、6、9号染色体居多。复制事件分析表明串联重复（TD）是家族扩张的主要驱动力（占60.7%）。表达分析揭示45.2%的NgTPS基因在根部高表达，且63.2%的根部高表达基因为TPS-a亚家族成员。
3.4. 基于体内实验的NgTPS-a亚家族成员功能验证
通过酵母异源表达，从31个候选基因中成功验证10个NgTPS-a酶的功能，它们能催化产生20种倍半萜。例如，NgTPS4专一合成(-)-β-(E)-佛手柑烯；NgTPS7/10均产生α-檀香烯和(E)-α-佛手柑烯；NgTPS34催化活性最广，可生成9种产物。这些酶产物与根部富集的倍半萜高度吻合。
3.5. 基于体外实验的NgTPS-a亚家族成员功能验证
体外酶活实验证实了上述酶的催化功能，并发现NgTPS34的产物谱具有pH依赖性：在酸性条件下（如酵母发酵）产生9种倍半萜，而在中性条件下则主要生成γ-榄香烯、β-榄香烯和Elixene。
3.6. EPY300::NgTPS菌株生产藤茶挥发性倍半萜
在高产FPP的工程酵母EPY300中表达功能NgTPS基因，实现了倍半萜的de novo合成。摇瓶发酵168小时，产量最高达21.51 mg·L-1（(E)-α-佛手柑烯，NgTPS7），展示了其生物技术潜力。
3.7. 功能NgTPS蛋白的亚细胞定位
亚细胞定位预测与实验验证显示，功能NgTPS蛋白定位多样，如NgTPS13/14/16/28定位于叶绿体，NgTPS4/7/19/34/79呈核-质双定位，NgTPS10特异定位于细胞膜，提示其代谢调控的复杂性。
本研究首次全面阐明了藤茶根部挥发性倍半萜的生物合成机制，揭示了MVA途径的关键贡献和TPS-a亚家族通过串联重复实现的功能多样化。功能验证的NgTPS酶为合成生物学提供了高效催化剂，成功在酵母中重构了倍半萜合成途径。该工作不仅深化了对藤茶次生代谢的理解，也为通过代谢工程改良其风味品质及微生物法绿色生产高值萜类化合物奠定了坚实基础。未来研究可聚焦于关键酶的三维结构解析、代谢调控网络挖掘以及这些倍半萜的生态功能探索。
