《Redox Biology》：Acetyl-CoA acyltransferase 2 palmitoylation drives liver fibrosis by inducing hepatic stellate cell ferroptosis
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本研究聚焦于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）中肝纤维化的新机制。研究人员发现，脂肪酸β-氧化关键酶乙酰辅酶A酰基转移酶2（ACAA2）在肝星状细胞（HSC）中上调，并通过棕榈酰化修饰调控其亚细胞定位，进而抑制AMPK通路，促进SLC7A11/GPX4轴介导的铁死亡，最终加剧肝纤维化。抑制ACAA2或其棕榈酰化可有效缓解纤维化，为抗纤维化治疗提供了新的潜在靶点。
肝脏，这个人体内最大的化工厂，默默承担着解毒、代谢、合成等数百种 vital 功能。然而，在现代生活方式和代谢性疾病的冲击下，慢性肝病的发病率逐年攀升，其中，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，原名非酒精性脂肪性肝病NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病。肝纤维化是MASLD进展至肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌的关键环节，其核心在于肝星状细胞（HSC）的活化与增殖，导致过量的细胞外基质沉积，最终破坏肝脏的正常结构。尽管HSC的活化是肝纤维化的中心事件，但其背后复杂的调控网络，特别是代谢重编程与细胞死亡方式交叉对话的精细调控机制，仍是未解之谜，这也阻碍了有效抗纤维化疗法的开发。
近年来，一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）——在肝脏疾病中的作用逐渐浮出水面。它不同于传统的细胞凋亡，其特征是铁离子催化下致命的脂质过氧化物累积。有趣的是，脂肪酸代谢的异常与铁死亡敏感性密切相关，但连接脂肪酸代谢关键酶、铁死亡与HSC活化的具体分子桥梁尚不明确。乙酰辅酶A酰基转移酶2（Acetyl-CoA acyltransferase 2, ACAA2）是线粒体脂肪酸β-氧化的末端酶，在脂质代谢中扮演重要角色，然而其在肝纤维化，特别是与铁死亡关联中的功能，完全未知。此外，蛋白质的翻译后修饰，如可逆的棕榈酰化（palmitoylation），如何精确调控ACAA2的活性和功能，也是一个有待探索的全新领域。为了回答这些关键科学问题，由韩建雄、杨兴元等研究人员组成团队在《Redox Biology》上发表了他们的最新研究成果，揭示了ACAA2棕榈酰化在驱动肝纤维化中的核心作用。
为了深入探究ACAA2在肝纤维化中的作用机制，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究包含了临床样本分析，收集了来自中国科学技术大学附属第一医院肝胆胰外科的肝纤维化/肝硬化及正常肝组织。在实验模型方面，构建了CCl4（四氯化碳）诱导和蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的小鼠肝纤维化模型，并使用了ACAA2基因敲除（KO）小鼠及腺相关病毒（AAV）介导的细胞特异性过表达模型。在细胞水平，研究采用了人肝星状细胞系LX2、人肝癌细胞系HepG2及小鼠肝细胞系AML12进行培养，并建立了Transwell共培养系统模拟肝细胞与HSC的相互作用。技术手段包括分子生物学技术如蛋白质印迹（Western blot）、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学/免疫荧光染色；功能分析如细胞活力测定（MTT法）、线粒体膜电位检测（Rhodamine 123染色）、脂质过氧化指标（MDA、GSH/GSSG、Fe2+）检测；以及机制探索如酰基-生物素交换法（IP-ABE）检测蛋白质棕啶酰化、细胞核质分离等。
Elevated hepatocytic ACAA2 expression correlates with hepatic fibrogenesis
研究人员首先发现，在CCl4诱导的纤维化小鼠肝脏以及人纤维化/肝硬化组织中，ACAA2的蛋白表达水平显著上调，且与天狼星红染色的胶原沉积面积增加呈正相关。分离的小鼠原代HSC在体外活化过程中（第7天），ACAA2和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达同步达到峰值。此外，在Transwell共培养系统中，与HepG2肝细胞共培养能显著提高LX2细胞中ACAA2的mRNA水平，提示细胞间相互作用调控ACAA2的表达。
ACAA2 promotes hepatic stellate cell activation and ferroptosis through AMPK pathway modulation
在LX2细胞中过表达ACAA2，会抑制AMPK的磷酸化（p-AMPK），并下调关键的铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11的表达，同时升高脂质过氧化相关基因（ACSL4, LPCAT3）以及HSC活化标志物（ACTA2, TGF-β1）和纤维化标志物（COL1A1）的mRNA水平。相反，利用小干扰RNA（siRNA）敲低ACAA2或使用ACAA2-KO小鼠的原代HSC，则能激活AMPK信号，提升GPX4和SLC7A11水平，并抑制HSC的活化。ACAA2缺陷的细胞对GPX4抑制剂RSL3诱导的铁死亡表现出更强的抵抗力，线粒体膜电位更稳定，细胞活性更高，且脂质过氧化产物MDA和Fe2+积累减少，谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值升高。重要的是，使用AMPK抑制剂（Compound C）可逆转ACAA2敲低带来的抗纤维化和抗铁死亡效应，而AMPK激动剂（AICAR）则能挽救ACAA2过表达诱导的表型，证实AMPK是ACAA2下游的关键节点。
ACAA2-mediated hepatocyte-HSC crosstalk drives fibrogenic activation
通过共培养体系，研究发现，在HepG2肝细胞中过表达ACAA2，能够显著促进共培养的LX2细胞中α-SMA、COL1A1等活化标志物的表达。同时，过表达ACAA2的肝细胞自身会高表达促纤维化细胞因子（TGF-β1, IL-6, TNF-α）和趋化因子（CXCL10, IL-8, CXCL1）。使用超速离心去除细胞外囊泡的条件培养基处理LX2细胞，仍能诱导其活化，表明ACAA2调控的肝细胞通过分泌可溶性因子以旁分泌方式驱动HSC活化。反之，敲低肝细胞中的ACAA2则能抑制这种促活化作用。
Inhibition of ACAA2 palmitoylation attenuates HSC activation by suppressing ferroptosis
机制探索发现，在纤维化小鼠肝脏中，ACAA2的棕榈酰化水平显著升高。研究人员鉴定出棕榈酰转移酶DHHC21负责ACAA2的棕榈酰化。使用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸（2-BP）处理LX2细胞，能减少ACAA2在线粒体中的定位，增加其在胞质中的分布。更重要的是，研究人员构建了ACAA2的非棕榈酰化突变体（AASS）。与野生型ACAA2（wt-ACAA2）相比，表达AASS突变体的LX2细胞表现出p-AMPK、GPX4和SLC7A11水平升高，α-SMA表达降低，脂滴形成减少，并且抑制了转录因子NRF2和ATF4的核转位，从而削弱了它们对SLC7A11启动子的结合。功能上，wt-ACAA2过表达会抑制LX2细胞增殖、诱发铁死亡特征（脂质过氧化、铁积累、GSH耗竭、线粒体膜电位崩溃），并可被铁死亡抑制剂Lip-1挽救，而AASS突变体则无此作用。细胞周期分析显示wt-ACAA2能将细胞阻滞在G1/S期。
ACAA2 deficiency attenuates liver fibrosis via GPX4-mediated ferroptosis
在体实验证实，在CCl4和MCD诱导的肝纤维化模型中，ACAA2基因敲除小鼠相比野生型小鼠，肝脏损伤（血清ALT、AST）、胶原沉积（天狼星红染色）、HSC活化（α-SMA染色）以及铁死亡指标（MDA、Fe2+升高，GSH/GSSG降低）均显著减轻，GPX4和SLC7A11蛋白水平升高。而给予铁死亡诱导剂RSL3，则能逆转ACAA2敲除带来的保护作用，重新加剧纤维化和铁死亡。反之，通过AAV病毒在ACAA2-KO小鼠的HSC中特异性回补野生型ACAA2，会加重纤维化和铁死亡，而这种效应可被Lip-1抑制。回补非棕榈酰化的AASS突变体则无明显影响。在肝细胞中特异性过表达ACAA2也会加剧肝脂肪变性、损伤和纤维化。
本研究结论清晰地表明，ACAA2，特别是其棕榈酰化修饰，在肝纤维化进程中扮演了“助推器”的角色。在肝损伤背景下，ACAA2在肝细胞和HSC中表达上调并经DHHC21催化发生棕榈酰化，此修饰促进ACAA2定位于线粒体，进而抑制AMPK信号通路活性，导致下游铁死亡关键防御体系SLC7A11/GPX4轴功能受损，最终诱发HSC发生铁死亡并活化，分泌大量细胞外基质，驱动肝纤维化发展。同时，ACAA2增强的肝细胞还通过分泌促炎和促纤维化因子，以旁分泌方式进一步加剧HSC活化。
这项研究的重大意义在于，首次将脂肪酸氧化酶ACAA2、其棕榈酰化修饰、铁死亡以及HSC活化这几个看似独立的过程有机地串联起来，揭示了代谢调控与细胞死亡在肝纤维化中的新颖交叉对话机制。它不仅深化了对MASLD相关肝纤维化发病机理的理解，更重要的是，将ACAA2的棕榈酰化位点确立为一个潜在“可成药”的靶点。针对这一特定修饰开发抑制剂，可能为实现精准、高效且副作用更小的抗肝纤维化治疗开辟全新的道路，为目前缺乏有效药物的MASLD患者带来了希望。当然，如作者所述，研究也存在局限性，如需在更多病因的肝纤维化模型中验证，并深入探讨ACAA2在肝脏巨噬细胞等其他细胞类型中的作用及其调控的上游机制。
