《Redox Biology》：Context-specific Angiogenin-mediated tRNA fragments (tDRs) biogenesis shapes the mitochondrial stress response.
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本研究针对线粒体功能障碍如何特异性调控tRNA衍生小RNA（tDRs）生成这一关键科学问题，通过系统分析不同线粒体应激源（复合物I-V抑制剂）和亚砷酸盐处理HEK293T细胞后tDRs的表达谱，发现血管生成素（ANG）依赖的tDRs生成具有应激特异性，其中抗霉素A主要诱导内部tRFs（i-tRFs）和3'tRF（tRF3s），而亚砷酸盐则产生tRNA halves（tiRNAs）。研究证实ANG缺失显著损害应激诱导的tDRs生成并增加细胞对应激的敏感性，而ANG过表达则增强tDRs生成并赋予保护作用。特别发现YBX1结合基序在抗霉素A诱导的tDRs中富集，且YBX1敲除可模拟线粒体生物能量增强和应激抵抗表型。该研究发表于《Redox Biology》，为理解tDRs在细胞应激响应中的调控机制提供了新视角。
在细胞生物学领域，转运RNA衍生的小RNA（tDRs，也称为tRFs或tsRNAs）已成为基因表达和细胞功能的关键调控因子，与癌症、中风、代谢紊乱、神经退行性变和衰老等多种病理过程密切相关。传统观点认为，tDRs主要是应激诱导的血管生成素（ANG）在反密码子处切割tRNA的产物，生成3'和5'tRNA halves（tiRNAs）。然而，随着研究的深入，tDRs的种类和功能日益复杂，包括多种异质亚型和亚类，可通过与Argonaute蛋白结合类似microRNA沉默靶mRNA，或与核糖体mRNA相互作用增强翻译，还能与RNA结合蛋白（如YBX1）相互作用调控mRNA稳定性。
尽管对tDRs功能的兴趣日益增长，但其生物发生机制仍知之甚少。ANG虽然是研究最深入的tRNA加工酶，但其他酶如SLFN11、SLFN2、DICER或RNase L也参与tDRs生成，且tRNA修饰与tDRs生物发生密切相关。最近的研究对tDRs功能提出了新挑战：早期认为tDRs通过翻译抑制和应激颗粒形成来抵抗氧化应激，但新证据表明氧化应激下tDRs（特别是tRNA halves）的产生与细胞死亡相关，而细胞保护干预措施可减少tDRs产生。
针对这些争议，研究人员在《Redox Biology》上发表了一项研究，探讨了tDRs在线粒体应激响应中的特异性作用。他们提出几个关键问题：细胞器应激（特别是线粒体应激）期间的tDRs产生是否与一般氧化应激不同？ANG是否参与应激期间多种tDRs亚型的生成？ANG是否通过tDRs产生赋予对氧化或细胞器应激的保护作用？单个tDRs是否能促进应激下的细胞存活？
为回答这些问题，研究团队使用HEK293T细胞模型，通过线粒体呼吸链复合物I-V抑制剂（鱼藤酮、TTFA、抗霉素A、KCN、寡霉素）或亚砷酸盐诱导应激，并评估CRISPR介导的ANG敲除、ANG过表达和重组ANG补充对应激响应和tDRs产生的影响。tDR测序揭示了应激特异性、高度有序的tDRs谱：鱼藤酮和抗霉素A主要诱导内部tRFs（i-tRFs）和3'tRF（tRF3s），而亚砷酸盐诱导反密码子切割的tRNA halves（tiRNAs）。线粒体tDRs（mito-tDRs）大多是内部片段，抗霉素A诱导最强的线粒体tDRs表达。
研究发现ANG缺失显著损害应激诱导的tDRs生物发生，并使细胞对抗霉素A和寡霉素应激敏感，而其过表达选择性增强tDRs生物发生并赋予对这些线粒体应激剂的保护作用。合成tDRs模拟物未能挽救细胞活力，提示需要天然修饰模式或协同的tDRs池。tDRs基序富集分析在抗霉素A诱导的tDRs中鉴定出YBX1结合位点，YBX1的遗传扰动模拟了增强的线粒体生物能量和应激抵抗方面。
研究的关键技术方法包括：使用线粒体呼吸链复合物抑制剂诱导应激；通过tDR测序分析tDRs表达谱；利用CRISPR/Cas9技术构建ANG和YBX1敲除细胞系；通过蛋白质印迹分析蛋白表达；采用MTT法和嘌呤霉素掺入法评估细胞活力和蛋白翻译；使用SYBR gold染色和DIG标记的Northern印迹检测tDRs。
研究结果首先显示不同线粒体应激源产生不同的tDRs亚型。通过tDR测序发现，应激特异性tDRs谱存在明显差异：抗霉素A主要诱导i-tRFs，鱼藤酮诱导i-tRFs和tRF3s，而亚砷酸盐优先诱导tiRNAs。线粒体tDRs大多是内部片段，抗霉素A诱导最强的表达。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示基于标准化tDRs计数的处理组间明显分离，表明tDRs谱存在显著的应激特异性异质性。
血管生成素对应激诱导的tDRs生成至关重要。研究发现，在基线条件下，ANG敲除或过表达对全局胞质tDRs谱仅有轻微影响。然而，ANG敲除显著降低应激诱导的tDRs生成，而ANG过表达增强抗霉素A暴露后的tDRs产生，但显著减弱亚砷酸盐和TTFA应激下的tDRs诱导。除了数量变化，ANG过表达还改变应激诱导tDRs的位置分布，从mock细胞中的主要i-tRFs转变为ANG过表达细胞中3'tRFs比例增加。
特别值得注意的是，外源性ANG而非合成tDRs保护细胞抵抗线粒体应激。重组ANG补充显著提高所有测试应激条件下的细胞活力，而合成tDRs转染未能重现内源性修饰tDRs的保护作用，甚至在某些条件下加剧应激敏感性。内源性tDRs可能通过RNA结合蛋白调节应激响应。基序富集分析发现，抗霉素A诱导的tDRs中特异性富集YBX1结合基序，而YBX1敲除导致线粒体生物能量改变和对应激抵抗增强。
研究结论部分强调，tDRs的产生是一个环境特异性和高度调控的现象，不同应激条件下从特定tRNA和切割位点产生不同的tDRs群体。重要的是，该研究首次证明线粒体呼吸复合物抑制足以诱导强大的tDRs产生，将tDRs生物学扩展到一般氧化应激剂的使用之外。ANG在线粒体应激响应中发挥核心作用，但其保护作用是环境依赖的。研究还提示内源性tDRs可能通过RNA结合蛋白（如YBX1）调节应激响应，而不是单个tDRs发挥离散功能。
这项研究的意义在于揭示了tDRs生物发生是线粒体应激响应的一个关键组成部分，为理解tDRs如何与RNA结合蛋白和细胞生物能量学在健康和疾病中相互作用提供了框架。特别是在神经退行性疾病如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症中，ANG突变与线粒体功能障碍密切相关，该研究为这些疾病的机制研究提供了新视角。
