《Reproductive BioMedicine Online》：hsa-miR-375-3p in embryo culture medium exosomes as a preimplantation non-invasive biomarker for predicting IVF pregnancy outcome
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胚胎体外培养液外泌体中非编码RNA作为评估胚胎质量的非侵入性生物标志物研究。通过收集妊娠成功与失败组胚胎培养液，分离外泌体并完成高通量小RNA测序，发现5种差异表达的miRNA、11种piRNA和8种tRFs。其中has-miR-375-3p在成功妊娠组显著高表达（AUC=0.763），其抑制实验证实该miRNA在4-8细胞阶段胚胎发育中起关键作用。
张灵颖|马伊雷帕蒂·马赫穆蒂|祖利胡玛尔·亚库普|李成宇|玉苏普江·迈迈提|庞敏|甘晓静|赵琼珍|黄卫东|翟伊丹·贾帕尔
中国新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源与基因工程重点实验室，新疆830046
摘要
研究问题
体外受精胚胎培养基中的外泌体是否含有可作为非侵入性检测标志物的非编码RNA，以评估胚胎质量？
设计
在获得知情同意的情况下，从患者的胚胎中收集了用过的培养基（SCM）。使用ExoQuick分离外泌体，然后通过高通量小RNA测序分析成功妊娠和妊娠失败的胚胎SCM中外泌体中的非编码RNA（ncRNAs），包括miRNAs、tRFs和piRNAs。接着应用接收者操作特征（ROC）分析来评估验证的miRNAs的诊断潜力。此外，设计针对差异表达miRNAs的特异性抑制剂，并将其微注射到小鼠胚胎中以评估其对胚胎发育的影响。
结果
免疫荧光证实了外泌体特异性标志物（CD63/CD9/CD81）的存在。对外泌体的小RNA测序鉴定出51种miRNAs、547种piRNAs和39种tRFs，其中5种miRNAs、11种piRNAs和8种tRFs表达有差异。通过qRT-PCR验证，成功妊娠的SCM外泌体中hsa-miR-375-3p和hsa-miR-215-5p的表达水平高于妊娠失败的SCM外泌体。ROC曲线分析表明，hsa-miR-375-3p（AUC=0.763，敏感性85%，特异性70%）可作为胚胎质量的评估指标，为基于miRNA的预测模型以改善IVF结果奠定了基础。此外，抑制hsa-miR-375-3p的表达显著阻碍了胚胎在4到8细胞阶段的发育。
结论
我们的发现表明，SCM外泌体中的hsa-miR-375-3p是一种非侵入性的预测生物标志物。此外，hsa-miR-375-3p在胚胎4到8细胞阶段的发育中起着关键作用。
引言
不孕症已成为一个紧迫的全球健康问题，世界卫生组织（WHO）估计全球约有17.5%的成年人受到影响。辅助生殖技术（ART）包括一系列旨在体外或体内操作配子以促进受精的技术，已成为治疗不孕症的基石。在ART中，体外受精-胚胎移植（IVF-ET）已成为临床实践中的主要方法，在发达国家中占所有分娩的1-5%（Richardson等人，2020年）。尽管IVF-ET被广泛使用，但其临床妊娠率仍然不理想，通常约为32%（Nargund等人，2001年）。妊娠失败的主要原因之一是移植胚胎的质量较差（Eisermann等人，2003年）。
形态学评估是一种常用的胚胎质量评估方法。目前，通常使用5级评分根据细胞数量、对称性和碎片化等视觉特征来评估胚胎质量（Das等人，2012年；Scott等人，2007年）。然而，形态学特征无法完全反映胚胎的生理和遗传特征。大约三分之一的符合着床前形态学筛选标准的胚胎仍然无法成功着床，这表明仅凭形态学特征不足以预测胚胎的发育潜力。为了在分子水平上评估着床前胚胎的质量，着床前遗传筛查/诊断（PGT）技术作为一种可行的评估方法应运而生，通过全面的基因组分析能够识别出无遗传疾病的整倍体胚胎（Esteki等人，2019年）。然而，在实施PGT过程中，需要使用机械、化学和激光辅助技术来侵入性地打开早期胚胎的透明带，以提取极体或少量分裂期细胞进行基因检测，因此安全性是其临床应用的关键决定因素（Cimadomo等人，2016年；Xu等人，2016年）。因此，有必要探索非侵入性生物标志物来筛选高质量胚胎，以提高妊娠率。
外泌体是由多种细胞类型分泌的膜结合的细胞外囊泡，在介导细胞间通信和调节关键发育过程中起着关键作用。外泌体的内容物，包括ncRNAs、蛋白质、核酸和脂质，与胚胎的存活率和妊娠结果越来越相关（Rincón-Riveros等人，2021年；Théry等人，2002年；Mathivanan等人，2012年）。已经分离并表征了着床前发育第3天和第5天的SCM来源的外泌体，提供了一种非侵入性的方法来评估胚胎状态。然而，使用SCM来源的外泌体中的ncRNAs进行早期胚胎质量评估的研究仍然不足。miRNAs是约22个核苷酸长的非编码RNA，通过与目标mRNA的3′非翻译区（3′UTRs）中的互补序列结合，发挥转录后调节作用，诱导mRNA降解或翻译抑制（Lee等人，2004年）。许多研究发现，miRNAs广泛参与调节多种生物过程，包括卵子受精、胚胎分裂、囊胚形成和着床（Omes等人，2024年；Hawke等人，2021年）。例如，在小鼠着床前SCM中检测到了与着床相关的miRNAs，如miR-101a、miR-126a-3p、miR-320、miR-29b和miR-143。功能研究表明，miR-29b的失调会破坏小鼠着床前胚胎的DNA甲基化，导致发育停滞（Zhang等人，2015年）。此外，研究发现miR-320在发育第3天和第5天的小鼠胚胎中高表达，其抑制显著降低了2细胞分裂和囊胚形成率（Feng等人，2015年）。总体而言，这些发现强调了外泌体miRNAs在早期胚胎发育中的重要性（Kotani等人，2021年）。
在这里，我们确定hsa-miR-375-3p是SCM中预测IVF妊娠成功的一个有前景的外泌体生物标志物。临床研究表明，形态正常（I级，8细胞阶段）胚胎的SCM中miR-375-3p水平在成功妊娠组显著较高，AUC为0.763（p<0.001）。此外，我们发现抑制miR-375-3p的表达会阻碍胚胎在4到8细胞阶段的发育，表明其在早期胚胎进展中的关键作用。综上所述，我们的发现表明miR-375-3p既是一种非侵入性的诊断标志物，也是一种经过功能验证的早期胚胎发生调节因子，对改进ART中的胚胎选择具有重要意义。
部分摘录
伦理声明
所有涉及人类样本的实验均符合中国新疆佳音医院伦理委员会批准的伦理指南（批准编号：JYLL-KY20190423-01）。所有参与者均已书面同意在本研究中使用SCM。
患者和样本收集
我们在四个月内招募了在新疆佳音医院生殖医学中心接受体外受精和胚胎移植（IVF-ET）的患者。受精评估后，选择I级8细胞阶段的胚胎
研究队列的特征
本研究招募了接受IVF-ET的不孕患者，他们的第3天I级8细胞胚胎（根据Gardner标准评估）被分为宫内妊娠组（n=34）和妊娠失败组（n=33，通过临床结果确认）。两组之间的基线人口统计和临床特征相当，包括年龄（31.64 ± 3.489岁 vs 33.75 ± 4.41岁，p=0.066）、BMI（23.27 ± 2.26 vs 23.97 ± 3.05，p=0.293）、不孕类型[50%（17/34）为原发性不孕
讨论
胚胎质量是IVF成功胚胎移植的核心决定因素。目前，高质量胚胎主要通过形态学评估和着床前遗传检测（PGT）来选择。然而，现有的评估系统存在显著局限性。即使被预先选为“高质量”的胚胎，在大约三分之一的情况下也无法实现成功妊娠和正常发育（Kimelman等人，2021年），这反映了现有方法的能力不足
资助
本研究得到了新疆自然科学基金（编号：2019D01A35）、天山人才培训计划（资助编号：2023TSYCCX0051）和中国国家自然科学基金（资助编号：81900287）的资助。
作者贡献声明
LZ、MM和ZY参与了研究构思和设计、实验实施、数据分析和手稿撰写。CL、YM和MP参与了微阵列数据分析。XG和QZ参与了手稿准备。WH和ZJ设计了项目并提供了资金支持。所有作者都对文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
翟伊丹·贾帕尔（PhD）是中国新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源与基因工程重点实验室的副教授。她的研究重点是外泌体来源的非编码RNA（ncRNAs）在调节胚胎发育和干细胞多能性中的作用和分子机制。
关键信息
为了探索非侵入性生物标志物以筛选高质量胚胎并提高妊娠率，我们发现了
