《Respiratory Physiology & Neurobiology》：The anti-Alzheimer potential of new spirooxindole derivatives containing 1,4-dihydropyridines as a targeted cholinesterase inhibitor
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本研究针对阿尔茨海默病（AD）治疗中胆碱能系统功能减退的关键病理环节，设计并合成了一系列结构新颖的螺氧化吲哚-1,4-二氢吡啶杂化衍生物。研究人员开发了一种绿色、高效的一锅法合成策略，并系统评价了其对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制活性。其中，化合物4i对BChE展现出纳摩尔级别的强效抑制活性（IC50= 5.32 ± 0.48 μM），其作用机制为混合型抑制，并通过分子对接、动力学模拟及细胞实验证实了其良好的结合模式、低细胞毒性及神经保护作用，为开发高选择性BChE抑制剂提供了有前景的先导化合物。
随着全球人口老龄化的加剧，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）这一最常见的神经退行性疾病，正日益成为沉重的社会与医疗负担。数以千万计的患者深受其害，表现为进行性的记忆丧失、认知功能下降和行为改变，其大脑内特征性的β-淀粉样蛋白斑块和Tau蛋白缠结导致了神经元的丢失和突触功能的损害。目前，提升大脑中关键神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）水平的策略，是缓解AD症状的主要手段之一。乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）和丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase, BChE）是负责分解ACh的关键酶。在AD晚期，AChE活性下降，BChE的作用则愈发重要，因此，开发能够有效抑制BChE的药物，特别是针对中重度AD患者，具有重要的临床意义。现有药物如多奈哌齐（Donepezil）和加兰他敏（Galantamine）主要靶向AChE，而卡巴拉汀（Rivastigmine）则是一种AChE/BChE双重抑制剂。然而，寻找高效、高选择性且安全性好的新型胆碱酯酶抑制剂，仍是当前药物研发的热点与难点。
在此背景下，研究人员将目光投向了具有丰富生物活性的天然产物骨架。螺氧化吲哚（Spirooxindole）结构广泛存在于多种天然产物中，如具有微管组装抑制活性的Spirotryprostatin A，以及能调节毒蕈碱和血清素受体活性的Pteropodine等。另一方面，1,4-二氢吡啶（1,4-Dihydropyridine）结构是药物化学中的“明星药效团”，著名的降压药硝苯地平（Nifedipine）、氨氯地平（Amlodipine）均含有此核心结构。将这两个优势骨架巧妙地融合在一个分子中，有望产生协同作用，为发现新型抗AD药物开辟新的途径。
本研究旨在设计、合成一系列新型的螺[吲哚-3,4-吡啶]-3-甲腈衍生物，并系统评价其抗AD潜力。研究人员发展了一种环境友好、高收率的一锅多组分反应方法，以靛红（Isatin）、丙二腈（Malononitrile）和1,1-烯二胺（EDAMs）为原料，高效地构建了目标化合物库。随后，他们对所有合成的衍生物（4a-o）进行了体外AChE和BChE抑制活性测试。
为了开展此项研究，作者运用了几个关键的技术方法：首先，他们优化并建立了合成目标螺氧化吲哚衍生物的多组分反应体系。其次，采用改良的Ellman法测定化合物对AChE和BChE的半数抑制浓度（IC50）。接着，对活性最优的化合物进行了酶动力学研究以确定其抑制类型和常数（Ki）。此外，利用分子对接和分子动力学（MD）模拟技术深入探究了先导化合物与BChE靶点的相互作用模式和结合稳定性。最后，通过MTT法在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系上评估了化合物的细胞毒性及其对过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激损伤的神经保护作用。计算机模拟（in silico）也被用于预测化合物的类药性和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质。
研究结果
胆碱酯酶抑制活性与构效关系（SAR）分析
活性测试结果表明，大部分化合物对BChE表现出优于AChE的选择性抑制活性。其中，化合物4i（R1为5-Cl，R2为4-CH3）对BChE的抑制活性最为突出，其IC50值达到5.32 ± 0.48 μM，甚至优于阳性对照药多奈哌齐（IC50= 10.6 ± 2.1 μM）。构效关系分析揭示：在螺氧化吲哚骨架的R1位引入吸电子基团（如5-Cl, 5-F, 5-NO2）通常有利于提高BChE抑制活性，而供电子基团（如5-OCH3）则效果不佳。在吡啶环的R2位，较小的供电子基团（如4-CH3）与R1位的吸电子基团（5-Cl）存在协同效应，能显著增强抑制效力，如化合物4i和4m（R1=5-Cl, R2=3,4-diCH3, IC50= 7.17 ± 1.62 μM）。
4i的酶动力学与抑制机制研究
对活性最强的化合物4i进行了详细的酶动力学分析。Lineweaver-Burk图显示，4i对BChE的抑制类型为混合型抑制，这意味着该化合物既能与游离酶结合，也能与酶-底物复合物结合。计算得到的抑制常数Ki为4.2 μM，而其对酶-底物复合物的抑制常数Kis为31.03 μM。这一结果从动力学角度证实了4i的作用机制，为其高效抑制活性提供了理论依据。
分子对接与分子动力学模拟揭示结合模式
为深入理解4i与BChE的相互作用，研究人员进行了分子对接和100纳秒的分子动力学模拟。对接结果显示，4i能够稳定地结合在BChE的活性空腔中，其对接打分值为-11.069 kcal/mol。具体而言，4i分子中的硝基与催化三联体中的关键丝氨酸残基（Ser198）形成氢键，其吡啶环上的氨基与另一个关键组氨酸残基（His438）形成氢键（其中一个是水介导的）。此外，吲哚环上的氯原子与Gly197形成卤键，吲哚环本身还与His438存在π-阳离子和π-π堆积相互作用。这些密集的相互作用使得4i能够同时作用于酶的催化位点（CAS）和外周阴离子位点（PAS），实现了双位点结合。分子动力学模拟进一步证实了4i-BChE复合物的稳定性，整个模拟过程中体系的均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF）值均较低，表明结合非常稳定，关键相互作用在模拟时间内得以保持。
体外细胞水平的安全性及神经保护活性评估
化合物的安全性是成药性的关键。MTT实验表明，化合物4i在浓度高达100 μM时，对SH-SY5Y细胞仍未显示毒性，细胞活力未受显著影响，证明了其良好的生物相容性。此外，在H22诱导的氧化应激模型中，4i（10 μM）表现出显著的神经保护作用，能够将H22导致的细胞存活率下降（约66%）提升至82%，提示该化合物不仅能够抑制BChE，还可能通过减轻氧化应激来保护神经元。
计算机模拟ADMET性质预测
对先导化合物4i进行了计算机模拟ADMET性质预测。结果表明，4i符合Lipinski五规则和Pfizer规则，预示其具有良好的类药性。在吸收、分布、代谢、排泄和毒性方面，4i表现出中等的肠道渗透性，但血浆蛋白结合率较高；其主要可能被CYP1A2代谢，与CYP2C9和CYP2D6的相互作用较弱，这有助于降低潜在的药物-药物相互作用风险。毒性预测显示，4i无致癌性、无致突变性、无皮肤致敏性，急性及慢性口服毒性值均在可接受范围内，整体安全性预测良好。
研究结论与意义
本研究成功设计、合成并评价了一系列新型螺氧化吲哚-1,4-二氢吡啶杂化衍生物。综合生物学筛选、计算模拟和细胞实验结果表明，化合物4i是一个高效、高选择性的BChE混合型抑制剂。其卓越的活性源于其与BChE催化中心及外周位点的稳定、多位点结合。此外，4i在细胞水平上展现出低毒性和显著的神经保护作用，计算机模拟也预测了其良好的类药性和安全性。因此，化合物4i被确定为一个有巨大开发潜力的选择性BChE抑制剂先导化合物，为针对阿尔茨海默病，尤其是疾病晚期阶段的治疗策略提供了新的候选分子，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。
