一种快速的无洗涤AlphaLISA传感平台，可同时检测CRP、MxA和SAA，以帮助区分细菌性和病毒性感染

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A rapid wash-free AlphaLISA sensing platform for combined detection of CRP, MxA, and SAA to support the discrimination between bacterial and viral infections

基于直接共价连接技术优化了AlphaLISA平台，实现CRP、MxA和SAA三种炎症标志物的同步快速检测（16分钟内完成），检测限低至0.12 mg/L，临床验证显示与参考方法高度一致（相关系数>0.998），适用于区分细菌与病毒感染。

　　

作者：蔡云|欧晓琪|李子军|朱美婷|冯宁|肖伟|鲍林春|胡良山|张润坤

中国广东省公共卫生检测与评估工程技术研究中心，广东药科大学公共卫生学院，广州510310

摘要

在资源有限的条件下，及时准确地区分细菌性和病毒性感染仍然是一个临床挑战。本文开发了一种AlphaLISA平台，用于快速检测三种炎症生物标志物：C-反应蛋白（CRP）、黏病毒抗性蛋白A（MxA）和血清淀粉样蛋白A（SAA）。我们采用直接共价结合的方法对供体微球和受体微球进行了功能化处理，简化了试剂制备过程，并消除了生物素-链霉亲和素放大步骤的需要。该检测方法仅需10–20 μL的血清样本，通过两次8分钟的孵育即可完成。其检测限分别为CRP 7.8 μg/L、MxA 1.37 μg/L和SAA 0.12 μg/L，并具有较宽的线性范围。AlphaLISA平台表现出高特异性、几乎无交叉反应，并能有效抵抗血清干扰因素。使用医院样本进行的临床验证表明，AlphaLISA检测平台与现有参考方法在CRP和SAA检测结果上具有高度一致性，相关系数超过0.998。对于MxA，通过加标回收实验验证了其分析准确性，回收率在91.2%到106.4%之间。机制研究表明，由酞菁敏化的供体微球产生的单线态氧在激活受体微球上的Eu(III)复合物中起核心作用，从而实现了高效的信号传递。这项工作提出了一种简化的、多路复用的AlphaLISA方法，能够同时检测三种生物标志物，在床旁临床应用中具有巨大潜力。

引言

炎症反应是机体对病原体、组织损伤和免疫失调的关键防御机制。[1] 这一过程包括免疫细胞激活、细胞因子和趋化因子释放、血管扩张、白细胞募集以及组织修复等复杂过程。鉴于炎症在维持体内稳态中的关键作用，精确监测炎症具有重要的临床意义，尤其是在传染病[2]、[3]的鉴别诊断、慢性炎症[4]的管理以及个性化治疗策略的制定[5]方面。然而，传统的单一标志物检测方法往往不够准确，特别是在需要快速、多方面信息来区分细菌性和病毒性感染的重症监护场景中[6]。

在各种炎症生物标志物中，C-反应蛋白（CRP）、黏病毒抗性蛋白A（MxA）和血清淀粉样蛋白A（SAA）因其在感染检测中的互补作用而成为重要的诊断工具[7]、[8]。CRP是一种急性期蛋白，在细菌感染期间通常会升高，并与疾病严重程度相关；其水平在细菌暴露后6–8小时内上升，而在病毒感染中则相对稳定或仅轻微升高[9]。相比之下，SAA对细菌性和病毒性感染的反应更为迅速，在感染后5–6小时内即可显著升高，通常比CRP更早被检测到[10]。此外，MxA是一种I型干扰素诱导的蛋白，特异性地与病毒感染相关，是区分病毒性和细菌性炎症的可靠标志物[11]、[12]。这些生物标志物的不同表达动力学和刺激特异性突显了它们的互补诊断价值；因此，同时检测CRP、MxA和SAA可以更准确地区分细菌性和病毒性感染，提高早期诊断的准确性，并为炎症疾病的管理提供定制化的治疗决策支持，如图1所示。

尽管先前的研究已经探讨了CRP和SAA的联合使用，但由于SAA半衰期短、需要及时检测以及成本较高等实际限制，其常规临床应用受到限制，通常使用CRP作为替代指标[13]、[14]。然而，由于CRP和SAA在反应动力学和敏感性上的差异，它们不能完全互换。仅依赖这两种标志物可能导致诊断延迟或不准确[15]。引入MxA（一种病毒特异性干扰素诱导蛋白）可为病毒感染检测提供关键的特异性。CRP、MxA和SAA的联合检测能够实现协同诊断策略，提高检测准确性，减少误诊，从而有助于复杂且时间敏感病例的临床决策。

为了满足日益增长的临床需求，即及时准确地评估炎症标志物，多种免疫测定技术已被广泛采用。酶联免疫吸附测定（ELISA）因其高特异性而成为标准方法；然而，其多步骤操作、较长的处理时间和相对较大的样本体积限制了其在快速检测或床旁检测（POCT）中的应用[16]、[17]。免疫浊度测定操作简便，但灵敏度有限且易受样本浑浊度影响，导致假阴性率较高[18]。传统的化学发光免疫测定（CLIA）虽然自动化程度较高，但依赖对pH值和温度等环境变化敏感的酶促信号放大系统[19]。此外，当前的CLIA平台通常需要针对每种分析物进行单独检测，使得多标志物的检测效率低下且资源消耗大。

当需要检测多种生物标志物时，这些局限性尤为突出，因为大多数现有方法无法同时提供所需的灵敏度、速度和多路复用能力，从而无法实现及时准确的临床评估。在这种背景下，放大的发光近距均相免疫吸附测定（AlphaLISA）作为一种有前景的替代方案应运而生。该技术由Ullman及其同事在1990年代开发，是一种无需洗涤的均相测定方法，通过供体微球（DMSs）和受体微球（RMSs）之间的近距能量转移机制实现[20]。在680 nm激发下，DMSs产生单线态氧（¹O₂），当分析物连接这两个微球时，产生的单线态氧会激活附近的RMSs，从而在610 nm处发出光信号。AlphaLISA具有多项技术优势：简化了操作流程（无需洗涤步骤），将检测时间缩短至20分钟以内，并利用微球的高表面积和化学灵活性提高了灵敏度和动态范围。此外，通过将不同抗体与不同微球结合，该平台能够快速定量多种生物标志物。这些优势使得AlphaLISA在快速多参数炎症诊断中具有广泛应用潜力[21]、[22]。

基于此原理，我们的团队之前开发了一种用于检测多种临床相关炎症标志物（包括CRP、干扰素-γ和降钙素原）的AlphaLISA检测平台。该平台表现出显著的快速检测速度和宽线性范围，适用于床旁检测（POCT）[23]。AlphaLISA检测的成功实施关键在于DMSs和RMSs的制备和功能化。特别是将抗体高效稳定地结合到微球上是决定检测系统特异性和信号输出的关键步骤。尽管AlphaLISA以其快速检测能力和无需洗涤的操作而广受认可，但功能化微球的上游制备过程仍需大量时间和技术投入。与早期使用醛基反应基团将抗降钙素原抗体固定到乳胶微球的方法相比（反应时间长达48小时），我们引入了硫代-NHS/EDC介导的耦合策略，将耦合过程缩短至7小时以内[24]。这些技术改进简化了整体流程，显著提高了操作效率，使该方法更适用于临床应用。然而，为多分析物检测准备AlphaLISA试剂的整个过程仍然较为繁琐且耗时。

从实际应用的角度来看，减少试剂制备的时间和复杂性同时保持分析性能对于推广AlphaLISA在常规临床诊断和POCT中的应用至关重要。简化的制备流程缩短了周转时间，提高了重复性和成本效益，这对于将实验室检测方法转化为实用诊断工具至关重要。在本研究中，我们通过直接将抗体与羧基化的DMSs和RMSs在相同的缓冲条件和温度下结合，简化了AlphaLISA试剂的制备过程。这种统一的工作流程去除了对生物素和链霉亲和素组分的依赖，缩短了试剂制备时间，同时保持了分析性能。在此基础上，我们建立了一种无需洗涤的AlphaLISA检测平台，能够在标准96孔微孔板上同时检测CRP、MxA和SAA，且样本量小。所有孔孔进行16分钟的批量孵育，随后进行快速顺序读取，支持高效的高通量分析。这些特点使得该平台非常适合用于临床筛查与感染相关的炎症反应。

材料与化学品

有关化学品和仪器的详细信息见补充材料。

Eu(TTA)₃phen的制备

在本研究中，使用了三(2-噻诺酰三氟乙酮酸)(1,10-菲)铕(III)（简称Eu(TTA)₃phen）这种发光的β-二酮酸铕(III)复合物作为发光探针[23]。Eu(TTA)₃phen的制备包括合成和纯化两个主要步骤，具体过程见图S1。详细的实验方案见补充材料。

供体微球（DMSs）和受体微球（RMSs）的制备

AlphaLISA试剂制备方法的比较

在AlphaLISA检测中，试剂制备的复杂性和持续时间（尤其是抗体-微球结合步骤）对检测效率影响显著。以双抗体夹心格式检测目标抗原为例，传统的AlphaLISA试剂制备流程见图2A。制备好DMSs和RMSs后，DMSs与链霉亲和素结合，RMSs与抗体结合。

结论

本研究开发了一种快速且经济高效的无需洗涤的AlphaLISA检测平台，可用于同时检测CRP、MxA和SAA这三种与细菌性和病毒性感染相关的关键生物标志物。该检测方法表现出高灵敏度、优异的特异性，并能有效抵抗生理干扰因素。直接将抗体共价结合到DMSs和RMSs上简化了试剂制备过程，提高了检测的实用性。

作者贡献声明

蔡云：撰写初稿、数据可视化、研究、数据整理。欧晓琪：数据可视化、验证、研究、概念构思。李子军：数据可视化、验证、软件开发、正式分析。朱美婷：数据验证、软件开发、正式分析。冯宁：数据可视化、验证、资源协调。肖伟：项目监督、项目管理。鲍林春：撰写、审稿与编辑、项目管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22074023）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2024A1515012029）、广东省农村科技专项（编号：KTP20200174）以及广州市科技研究计划（编号：2023A03J0283）的支持。

蔡云于2022年毕业于广东医科大学，目前是广东药科大学公共卫生学院的研究生。她的研究兴趣包括快速化学发光检测技术，特别是发光近距均相免疫测定的开发与应用。