用于急性酒精性肝损伤期间连续监测一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐的逻辑门荧光探针

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Logic-gated fluorescent probe for sequential monitoring of NO and peroxynitrite during acute alcoholic liver injury

急性酒精性肝损伤（AALI）的氧化应激机制研究，开发了一种逻辑门荧光探针MNO-ONOO，可依次检测NO和ONOO?，揭示其动态关联及肝损伤机制。

　　

郑周鹏|张金正|刘一佳|刘永恒|冯国强

教育部光能利用工程研究中心（用于污染控制和碳减排），华中师范大学化学学院，中国武汉珞喻路152号，430079

摘要

急性酒精性肝损伤（AALI）以线粒体氧化还原稳态失调为特征，由于其动态的时空氧化还原失调，在肝病学中仍是一个未解决的挑战。本文设计了一种逻辑门控荧光探针（MNO-ONOO），用于顺序检测一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐（ONOO?），这两种物质与AALI密切相关。在生理条件下，MNO-ONOO最初处于闭合环构象，以掩盖其对ONOO?的敏感部分。NO触发脱氨反应，生成一种靶向线粒体的近红外（NIR）荧光中间体，从而暴露出ONOO?的活性位点。随后的ONOO?介导的切割产生比率荧光信号，反映了NO和ONOO?之间的病理生理过程。MNO-ONOO表现出优异的选择性和灵敏度，对NO和ONOO?的检测限分别为9 nM和28 nM。该探针成功地在RAW264.7细胞（LPS诱导的炎症）和HepG2细胞（乙醇诱导的损伤和铁死亡）中可视化了NO/ONOO?的动态变化。利用AALI小鼠模型，MNO-ONOO进一步显示了肝脏病变区域NO/ONOO?的持续升高，这一结果通过组织病理学分析得到验证，并通过水飞蓟素干预减轻了过度产生。通过阐明线粒体氧化还原信号传导中NO/ONOO?的相互依赖性，该探针能够精确绘制氧化应激图谱，为解码AALI的发病机制提供了框架。

引言

急性酒精性肝损伤（AALI）是由急性过量饮酒引起的一种危及生命的并发症[1]，[2]，其核心特征是线粒体氧化还原失衡[3]。这种失衡与一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐（ONOO?）的动态变化密切相关，NO-ONOO?级联反应是疾病进展的关键驱动因素[4]。乙醇暴露会急性激活NADPH氧化酶，导致细胞质中超氧阴离子（O₂^•?）的快速过量生成[5]。通常情况下，NO通过调节血管张力和抑制凋亡来保护肝细胞存活[6]。然而，在乙醇应激下，过量的O₂^•?与NO反应生成ONOO?，这是耗尽NO生物利用度并使剩余NO进入线粒体的关键步骤，从而损害线粒体功能[4]。线粒体中ONOO?的过量积累会破坏电子传递链功能，加剧电子泄漏并进一步产生O₂^•?[7]。这一级联反应加速了脂质过氧化和铁死亡[7]，[8]。值得注意的是，铁死亡是AALI发病机制的核心驱动因素，因为其发生与肝脏脂质ROS的积累和坏死炎症反应密切相关[9]。因此，在AALI的病理过程中监测NO和ONOO?的代谢级联对于阐明它们的因果关系和铁死亡的调控机制至关重要。

荧光成像是一种用于活体系统中生物标志物检测的基石技术，因为它具有非侵入性监测、实时可视化和亚细胞分辨率成像的独特优势[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]。尽管在开发NO和ONOO?荧光探针方面取得了显著进展，但目前的策略主要集中在单一分析物的检测上[16]，[17]，[18]。例如，基于邻苯二胺的探针可以通过硝基化和随后的环化反应选择性地识别NO[19]，[20]，[21]，而烯烃功能化的传感器则通过C=C双键的氧化切割实现特定的ONOO?检测[22]，[23]，[24]，[25]。然而，目前还没有一种荧光探针能够在AALI期间同时实现逻辑门控区分和检测NO和ONOO?。

在这里，我们报道了一种逻辑门控荧光探针MNO-ONOO，可用于在AALI期间顺序区分和检测NO和ONOO?。如图1所示，该探针处于闭合环构象，不显示荧光。当遇到NO时，邻苯二胺部分发生硝基化[26]，[27]，转化为带正电的开链吲哚中间体M3，从而激活近红外（NIR）荧光并实现NO的检测。中间体M3可以特异性地靶向线粒体，随后与ONOO?反应，导致共轭切割并生成具有绿色荧光的MA，从而产生比率荧光信号并实现ONOO?的检测。这一过程遵循精确的顺序：NO启动激活级联反应，随后ONOO?介导下游调控。这种独特的逻辑门控设计使得能够顺序区分NO和ONOO?，从而揭示它们在活体系统中的相互关系。值得注意的是，在细胞水平上，我们利用MNO-ONOO成功检测到了铁死亡过程和乙醇诱导的细胞损伤期间NO和ONOO?的异常水平，并描绘了它们的动态相互作用。此外，我们还使用该探针在AALI小鼠模型中实现了肝脏内NO/ONOO?波动的实时可视化。这不仅为追踪活体系统中NO和ONOO?的动态变化提供了一种新工具，还为理解AALI的病理进展机制提供了重要见解，突显了该探针在解析复杂分子级联中的重要作用。

MNO-ONOO的合成

M3首先通过已报道的方法合成[29]。在氮气氛围下，将M3（198 mg，0.30 mmol）、邻苯二胺（97 mg，0.90 mmol）和PyBOP（53 mg，0.10 mmol）溶解在15 mL无水乙醇中。溶液在回流条件下加热60小时。反应完成后，通过旋转蒸发去除溶剂。粗产物通过石油醚/乙酸乙酯（1/1）的快速柱层析纯化，得到黄色固体（72 mg，37%）。¹H NMR（400 MHz），

MNO-ONOO对NO和ONOO?的反应

MNO-ONOO的顺序激活逻辑通过UV-vis光谱验证（图1A）。单独与ONOO?孵育没有引起光谱变化，证实其对ONOO?的惰性。然而，在NO处理后，探针在380 nm处显示出明显的吸收减少，并在713 nm处出现新的峰，表明其被NO特异性激活。随后向NO激活的探针溶液中添加ONOO?，使713 nm处的吸收减弱，380 nm处的吸收部分恢复，表明

结论

总之，我们成功合成了一种逻辑门控荧光探针（MNO-ONOO），实现了在AALI期间对NO和ONOO?的逻辑门控区分和检测。该探针采用“NO触发，然后ONOO?调节”的两步激活机制，其中NO激活探针的NIR荧光，随后ONOO?激活绿色荧光。这一序列提供了一种新的方法，用于顺序区分和检测NO和ONOO?。基于此，该探针

CRediT作者贡献声明

刘一佳：撰写——原始草稿，研究，形式分析。张金正：撰写——原始草稿，研究，形式分析。郑周鹏：撰写——原始草稿，方法学，研究，形式分析，数据管理。冯国强：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，研究，资金获取。刘永恒：撰写——原始草稿，研究，形式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22077044）和中央高校基本科研业务费（CCNU24JCPT021）的支持。

郑周鹏是中国华中师范大学化学学院的博士生。