《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Chitosan–collagen–G-90 biofilm enhances wound closure and collagen remodeling: FTIR imaging and PCA-kNN analysis
编辑推荐：
壳聚糖基生物膜通过FTIR微光谱和主成分分析结合k-最近邻分类，证实chitosan–ACS–G-90组显著加速伤口闭合并促进胶原蛋白重组，验证了多变量分析在真皮ECM重塑研究中的高效性。
Fatemeh Elmi | Maryam Mitra Elmi | Lisa Vaccari | Diana E. Bedolla
伊朗马赞德兰大学海洋与环境科学学院海洋化学系，巴博尔斯尔
摘要
本研究开发了含有不同生物活性成分的壳聚糖基生物膜，以评估其对大鼠皮肤组织伤口愈合的影响。比较了四种配方：纯壳聚糖、壳聚糖-胶原蛋白（ACS）、与蚯蚓糖脂蛋白提取物结合的壳聚糖（壳聚糖-G-90），以及三种成分的混合物（壳聚糖-ACS-G-90）与未经处理的对照组。受伤14天后，壳聚糖-ACS-G-90组的伤口闭合情况最佳。比率映射（1325–1351 cm?1/1190–1357 cm?1）显示，壳聚糖-ACS-G-90膜在胶原蛋白重组方面提供了最显著的改善，突显了其在基质成熟过程中的优越作用。蛋白质（1710–1475 cm?1）和指纹区域（1800–900 cm?1）的归一化二阶导数光谱显示，胺I/II谱型、胶原蛋白三螺旋标记（1338 cm?1, 1203 cm?1）以及碳水化合物相关区域（约1150–1000 cm?1）的吸收具有处理依赖性变化。这些谱带通常归因于糖胺聚糖或其他细胞外基质（ECM）多糖，但也可能包含来自胶原蛋白侧链和核酸磷酸基团的叠加贡献，反映了皮肤ECM复杂的生化组成。主成分分析（PCA）明确将壳聚糖-ACS-G-90组与未经处理的真皮区分开来，其载荷与交联相关谱带（约1690 cm?1）和胺I/II谱带（约1658 cm?1, 1566–1543 cm?1）相关。使用k-最近邻（kNN）对PCA得分进行分类，获得了高准确率（AUC = 0.993）。这些结果表明，壳聚糖-ACS-G-90可加速伤口闭合并促进胶原蛋白重塑。
引言
皮肤再生是一个复杂的过程，涉及炎症、细胞增殖以及细胞外基质（ECM）的沉积和重塑[1]。皮肤作为最大且最活跃的器官，其细胞和ECM成分不断更新。皮肤的机械完整性和屏障功能在很大程度上依赖于胶原蛋白纤维的三维（3D）结构，I型胶原蛋白是成人和胎儿真皮中的主要ECM成分[2], [3]。在严重损伤或烧伤的情况下，成纤维细胞驱动的胶原蛋白、蛋白多糖和其他ECM分子的合成会产生肉芽组织[4]。然而，新沉积的胶原蛋白往往组织混乱，导致机械强度下降。因此，疤痕组织很少能恢复未受伤皮肤的拉伸性能[5]。
伤口敷料在调节愈合环境中起着关键作用。虽然纱布和绷带等传统材料被广泛使用，但它们会吸收过多的渗出物，延缓愈合过程，并在移除时引起疼痛。相比之下，基于聚合物的敷料（包括生物膜、水凝胶和泡沫）能够保持有利于愈合的湿润伤口环境[6], [7]。基于壳聚糖的敷料因其抗菌活性、生物相容性和透气性而特别受到关注[8], [9], [10]。例如，羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖水凝胶具有抗粘附性能，可加速烧伤愈合[11]；γ-辐照壳聚糖/明胶/聚乙烯醇水凝胶则具有优化的止血性能[12]。基于胶原蛋白的生物材料同样支持止血、细胞粘附和增殖[13], [14], [15]，如冻干的水母胶原蛋白海绵[16]和静电纺制的罗非鱼来源I型胶原蛋白支架所示，这些材料可在14天内促进大鼠伤口的完全表皮覆盖[17]。糖脂蛋白（G-90）是一种具有抗氧化、抗凝血和促进生长因子活性的生物活性物质，它可以上调转化生长因子（TGF）和表皮生长因子（EGF），促进成纤维细胞迁移、ECM沉积和新生血管形成，同时减轻氧化应激[18], [19]。
傅里叶变换红外（FTIR）微光谱是一种无标记、非破坏性的技术，能够在微观尺度上空间分辨生物组织的生化谱型[20]。它能够检测蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物的振动特征，从而灵敏地评估ECM的组成和结构[21], [22], [23], [24]。在皮肤研究中，FTIR微光谱已被用于监测疾病进展和组织修复过程中的蛋白质二级结构变化、胶原蛋白降解和脂质重组[25]。与胶原蛋白相关的光谱区域（1350–1190 cm?1）包含δ(CH?)和δ(CH?)振动以及胺III谱带，这些特征反映了胶原蛋白含量、三螺旋稳定性和纤维组织结构[26], [27], [28]。受伤14天后，I型胶原蛋白在真皮中占主导地位，取代了早期的III型胶原蛋白，而弹性蛋白含量则很少[29], [30], [31]。纤维连接蛋白、tenascin-C以及decorin和biglycan等蛋白多糖的水平暂时升高，促进了成纤维细胞的迁移和胶原蛋白纤维的形成[32]。先前的FTIR成像研究已经绘制了伤口闭合过程中的生化变化图谱[33]，并证明I型胶原蛋白/G-90复合材料可以增强真皮中的胶原蛋白覆盖同时减少氧化应激[34]。
在本研究中，使用基于焦平面阵列（FPA）的FTIR成像技术评估了壳聚糖、壳聚糖-鱼鳞胶原蛋白（ACS）、壳聚糖-蚯蚓（Esenia foetida）糖脂蛋白提取物（G-90）和壳聚糖-ACS-G-90生物膜对大鼠皮肤伤口的生化影响。获取了高分辨率的化学图像以表征特定处理的胶原蛋白重塑情况。通过主成分分析结合k-最近邻（PCA-kNN）的多变量分析，识别出了不同的生化特征并准确分类了伤口状态。本研究的总体目标是利用空间分辨的FTIR成像和多变量分析来研究皮肤伤口愈合过程中的治疗相关生化变化。
材料与方法
低分子量壳聚糖（脱乙酰化程度为75–85%）购自Sigma-Aldrich（美国）。酸溶性胶原蛋白（ASC）按照先前报道的酸性提取方法从白鱼鳞片中提取[35]，详细步骤见补充信息（S.1节）。糖脂蛋白（G-90）根据[19]描述的方案从蚯蚓（Esenia foetida）中提取。含有ASC和/或G-90的壳聚糖基生物膜按照以下方法制备：
伤口闭合的评估
对伤口面积的定量评估显示，壳聚糖组和壳聚糖-ASC-G-90组的伤口闭合情况明显优于未经处理的对照组（图1）。经过14天的处理后，使用壳聚糖-ACS-G-90基生物膜处理的动物的伤口面积显著减小（p < 0.001），证实了这些生物材料在促进组织再生方面的治疗效果。尽管所有处理组的伤口愈合都有明显改善
结论
本研究证明，当FTIR微光谱与先进的多变量分析结合使用时，为定量表征伤口愈合过程中的真皮ECM重塑提供了一个强大的、非破坏性的平台[39], [40], [52]。通过将二阶导数FTIR光谱与PCA-kNN分类相结合，我们实现了几乎完美的负对照组和壳聚糖-ACS-G-90处理真皮之间的区分（AUC = 0.993；CA = 0.976），突显了这种方法的可靠性
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
Fatemeh Elmi和Maryam Mitra Elmi感谢伊朗科学、技术和知识经济 vice presidency 的国际科学技术合作中心、基础科学研究所和伊朗光源设施对项目的财政支持。他们还感谢Elettra Sincrotrone Trieste提供FTIR微光谱设施的支持，以及ICTP在ICTP-Elettra用户计划下的财政支持
