《Nature Communications》：Af-CUT&Tag: a sensitive and antibody-free chromatin profiling method using genetically encoded tags and high-affinity binders fused to Tn5
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本研究针对传统染色质分析技术受限于抗体可用性和性能的瓶颈，开发了名为Af-CUT&Tag的新型无抗体染色质分析技术。研究人员通过CRISPR整合肽标签(HiBiT/ALFA-tag)与工程化结合子(LgBiT/NbALFA)融合Tn5转座酶的策略，实现了在500个细胞水平的高灵敏度染色质图谱绘制。应用该技术揭示了Hippo通路效应因子YAP1/TAZ在肝脏再生过程中通过调控脂质代谢基因(Lpin1、Fasn等)和血红素清除基因(Hpx、Trf)介导染色质动态重塑的重要机制，并发现miR-122是调控这一过程的关键因子。该技术为发育、疾病和再生研究提供了强大工具。
在生命科学研究的广阔天地中，科学家们一直致力于解开基因调控的奥秘。染色质景观分析技术如同探照灯，照亮了转录因子结合位点、DNA结合蛋白和核小体特征的精确图谱。然而，传统技术如ChIP-seq及其升级版CUT&Tag和Nano-CUT&Tag，都面临着一个共同的"阿喀琉斯之踵"——对目标抗体的依赖。抗体质量参差不齐、分子量大导致细胞穿透性差、蛋白质翻译后修饰干扰结合效率等问题，如同迷雾般阻碍着研究人员对表观遗传调控机制的深入探索。
面对这一挑战，厦门大学张永友教授团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究，开发了一种名为Af-CUT&Tag（抗体无关染色质分析技术）的全新方法。这项技术巧妙避开了传统抗体的限制，通过基因编码的肽标签系统实现了对染色质特征的高精度、高灵敏度分析。
研究人员的设计思路极具创新性：他们选用了两种高亲和力的短肽标签系统——HiBiT/LgBiT和ALFA-tag/NbALFA，将它们与Tn5转posase酶进行融合。HiBiT/LgBiT系统的解离常数（KD）为0.58 nM，而ALFA-tag/NbALFA系统更是达到了惊人的0.202 nM，这种纳米级别的亲和力保证了结合的特异性和稳定性。尤为重要的是，与大型抗体分子（150 kDa）相比，LgBiT-Tn5融合蛋白的分子量（70 kDa）更小，使其能够更轻松地穿越细胞核膜，无需进行核提取操作，大大简化了实验流程。
为了验证这一系统的可行性，研究团队首先在SW480和DLD1结直肠癌细胞系中进行了测试。他们通过CRISPR/Cas9技术将HiBiT和ALFA-tag标签精确插入到RNA聚合酶II最大亚基RPB1的C末端。结果表明，Af-CUT&Tag在启动子区域产生了比传统方法更强的信号积累，且仅需500个细胞就能获得高质量的数据，信噪比显著优于抗体依赖的方法。
技术的优势在CTCF（CCCTC结合因子）蛋白的染色质分析中得到了进一步体现。Af-CUT&Tag不仅能够在群体水平准确绘制CTCF的全基因组结合图谱，还成功拓展至单细胞分辨率，开发出了scAf-CUT&Tag（单细胞Af-CUT&Tag）技术。通过引入独特的条形码组合，研究人员实现了对单个细胞中转录因子结合位点的高通量分析，为研究细胞异质性提供了强大工具。
技术的真正价值在于解决重要生物学问题。研究团队将Af-CUT&Tag应用于肝脏再生这一经典模型，聚焦Hippo信号通路的关键效应因子YAP1和TAZ。通过构建Yap1/Taz-HiBiT基因敲入小鼠模型，并结合部分肝切除手术，研究人员揭示了肝脏再生早期YAP1/TAZ介导的染色质动态重塑机制。
令人惊讶的是，Af-CUT&Tag以前所未有的灵敏度捕捉到了再生过程中关键的调控事件。研究发现，YAP1/TAZ在肝脏再生早期通过调控一系列代谢相关基因的表达，为组织修复创造有利环境。其中，脂质代谢的重编程尤为突出：YAP1/TAZ在脂肪酸代谢酶和合成酶（如Acox1、Lpin1、Fasn、Scd1）启动子区域的富集显著降低，同时促进脂滴融合蛋白（Plin2、Cidec）和脂肪酸转运蛋白（Cd36、Fabp4）的表达，这种巧妙的代谢重构为肝细胞增殖提供了能量储备并减少了代谢副产物产生的炎症反应。
更为重要的是，研究首次发现miR-122在这一过程中扮演关键角色。Af-CUT&Tag检测到YAP1/TAZ在Mir122基因位点的富集显著增加，且伴随染色质可及性和H3K27乙酰化水平的提升。功能实验证实，肝脏特异性敲除miR-122会导致脂质过度积累、炎症反应加剧，并显著抑制肝细胞增殖标志物Ki-67和PCNA的表达，严重影响再生进程。
关键技术方法概述
本研究主要采用基因编辑技术构建内源性标签细胞系和小鼠模型，通过蛋白质工程制备高亲和力结合子-Tn5融合蛋白，建立无抗体染色质分析技术体系。利用部分肝切除小鼠模型获取再生肝组织样本，结合单细胞测序和空间转录组学分析，系统解析YAP1/TAZ调控肝脏再生的分子机制。样本来源包括人源细胞系和小鼠肝组织。
Af-CUT&Tag技术的开发与验证
研究人员首先通过体外结合实验证实了HiBiT/LgBiT-Tn5和ALFA-tag/NbALFA-Tn5系统的高亲和力。蛋白质纯化评估显示LgBiT-Tn5具有更好的溶解性和产量，因此被选为主要研究工具。在RPB1-HiBiT基因敲入细胞系中，Af-CUT&Tag在启动子区域显示出比传统方法更高的信号积累，且仅需500个细胞就能获得高质量数据，证明了其超高灵敏度。
CTCF结合位点的全基因组分析
在CTCF蛋白的染色质分析中，Af-CUT&Tag（HiBiT和ALFA-tag）与抗体依赖的Nano-CUT&Tag产生了高度相似的染色质景观。 motif分析证实了CTCF经典结合 motif的显著富集，且与ATAC-seq数据相比，Af-CUT&Tag能更有效区分CTCF特结合位点。单细胞水平的应用进一步证明了该技术在解析细胞异质性方面的优势。
肝脏再生中YAP1/TAZ调控机制的解析
通过AAV病毒介导的肝脏特异性Yap1/Taz-HiBiT基因敲入小鼠模型，结合部分肝切除手术，研究人员发现YAP1/TAZ在再生早期通过调控脂质代谢重编程促进组织修复。具体表现为下调脂肪酸合成基因（Lpin1、Fasn等），同时上调脂滴融合和脂肪酸转运基因，这种代谢转换为肝细胞增殖提供了必要的能量微环境。
miR-122在肝脏再生中的关键作用
Af-CUT&Tag以超高灵敏度检测到YAP1/TAZ在Mir122位点的富集增加。功能实验表明，miR-122缺失导致脂质代谢紊乱、炎症反应加剧和再生能力受损。机制上，miR-122通过调控铁离子代谢相关基因（Hfe、Tfr2、Ndrg3）和脂肪酸代谢调控因子E2F1，维持再生过程中的代谢稳态。
研究结论与意义
Af-CUT&Tag技术突破了传统染色质分析方法的抗体依赖限制，为表观遗传学研究提供了更灵敏、更可靠的工具平台。在生物学机制方面，该研究首次系统揭示了YAP1/TAZ通过协调脂质代谢重编程和miR-122调控网络促进肝脏再生的精细机制，为理解组织再生提供了新视角，也为肝脏疾病治疗提供了潜在靶点。技术的模块化设计使其能够广泛应用于各种生物体系和临床样本，结合人工智能辅助的蛋白质工程，未来有望成为染色质动力学研究的标准方法。
