《Nature Communications》：Coiled-coil heterodimer-mediated split base editing systems enable flexible and robust nucleotide substitutions
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为解决传统碱基编辑器尺寸过大而难以被AAV病毒有效包装递送的难题，研究人员开发了一种基于卷曲螺旋异源二聚体介导的拆分碱基编辑系统（CC-BE）。该研究通过将脱氨酶与nCas9分别融合到能够特异性二聚化的卷曲螺旋肽对（如P3/P4或N5/N6）上，成功构建了CC-CBE、CC-ABE等多种编辑器。研究结果表明，CC-BE系统在多种细胞类型和基因位点上均能维持甚至提升碱基编辑效率，并在小鼠模型中通过双AAV递送成功实现了对Pcsk9和Dmd基因的高效体内编辑，为基因治疗提供了更灵活、高效的平台。
在精准基因编辑领域，CRISPR碱基编辑器能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现单碱基的精准替换，为治疗由点突变引起的遗传病带来了巨大希望。然而，基于SpCas9的碱基编辑器尺寸过大，超出了常用递送载体——腺相关病毒（AAV）约4.7 kb的包装容量限制，这严重阻碍了其在体内的治疗应用。虽然科学家们已经开发了诸如内含肽介导的拆分编辑器或微型碱基编辑器等策略来应对这一挑战，但这些方法或存在设计复杂、可能因留下“足迹”而影响蛋白功能的问题，或面临编辑效率低、靶向范围有限等局限。因此，开发一种既灵活又高效的碱基编辑系统，以满足体内治疗的需求，成为了该领域亟待解决的关键问题。
针对这一瓶颈，发表在《Nature Communications》上的研究论文提出了一种创新的解决方案：卷曲螺旋异源二聚体介导的拆分碱基编辑系统（CC-BE）。研究人员巧妙地利用了卷曲螺旋肽段（如P3/P4或N5/N6对）能够通过疏水和静电作用形成特异性强、结合紧密的二聚体这一特性，将完整的碱基编辑器“拆分”成两个部分：一部分是脱氨酶（如胞嘧啶脱氨酶APOBEC3或腺嘌呤脱氨酶TadA8e）与一个卷曲螺旋肽（如P3或N5）的融合蛋白，另一部分是nCas9（Cas9切口酶）与另一个互补卷曲螺旋肽（如P4或N6）的融合蛋白。当这两个部分被共同递送到细胞中后，卷曲螺旋肽会像“分子磁铁”一样将脱氨酶和nCas9拉近，在靶DNA位点重新组装成有功能的碱基编辑器。
为开展此项研究，研究人员首先利用AlphaFold 3进行了蛋白质三维结构预测，证实了CC-BE系统的可行性。他们构建了多种CC-BE版本，包括CC-CBE（如CC-BE3）、CC-ABE（如CC-ABE8e）以及它们的衍生工具（如CC-TadCBE、CC-ABE9和CC-AYBE）。研究的关键技术方法包括：利用质粒转染（如PEI、电穿孔）将编辑器组分导入多种细胞系（如HEK293T、小鼠胚胎成纤维细胞MEF、猪胎儿成纤维细胞PFF）进行体外效率验证；通过双AAV载体（血清型8和9）包装CC-BE组件，并通过腹腔或肌肉注射等方式递送至小鼠体内进行体内编辑评估；采用荧光激活细胞分选（FACS）富集转染细胞，并通过高通量测序（如下一代测序）精确分析靶位点的碱基编辑效率、旁观者编辑及indel频率；利用全基因组测序（WGS）全面评估系统的脱靶效应；并通过免疫荧光染色、RT-PCR、Western Blot以及血清生化指标检测等手段，在杜氏肌营养不良症（DMD）的△Ex51小鼠模型和野生型小鼠模型中验证了CC-BE的治疗效果。
CC-CBE具有高编辑活性和扩展的靶向范围
研究人员首先开发了基于卷曲螺旋的拆分胞嘧啶碱基编辑器（CC-CBE）。结果表明，在HEK293T细胞中多个内源位点，sCBE-P3P4和sCBE-N5N6的C-to-T编辑效率显著高于未拆分的BE3和直接拆分的对照组（sCBE-ctrl），平均提升分别达到2.8倍和2.9倍，并且在某些位点（如RNF2 site 2）提升高达9.6倍。同时，CC-CBE的编辑窗口（position 3-13）相较于传统BE（position 4-8）更宽。研究还通过对比不同核定位信号（NLS）数量的编辑器以及Western Blot分析，排除了NLS数量或Cas9蛋白表达水平差异是效率提升的主要原因，推测卷曲螺旋肽引起的构象变化可能是关键。
CC-ABE系统展现高效编辑效率
类似地，研究人员构建了CC-ABE系统（如CC-ABE8e）。在13个人类基因组位点的测试中，CC-ABE（sABE-P3P4和sABE-N5N6）展现了与未拆分ABE8e相当甚至更高的A-to-G编辑效率，并且其编辑窗口（A9-A14）的活性更高。研究还开发了基于拆分Cas9的迭代版本CC-ABE，以潜在地降低Cas9依赖性脱靶活性，结果显示其编辑效率与未拆分系统相似且未增加indel。
工程化CC-BE变体：TadCBE, ABE9和AYBE
为了验证CC策略的普适性，研究人员将其应用于其他碱基编辑器变体。开发的CC-TadCBE在C-to-T编辑效率上显著高于未拆分的TadCBE和直接拆分的对照组。CC-ABE9实现了精确的A-to-G编辑，而CC-AYBE则成功实现了A-to-Y（A-to-C/A-to-T）的颠换编辑，且脱靶indel产物水平可控。
扩展CC-BE系统的靶向范围
通过使用识别更宽松PAM（NG）的SpCas9-NG变体，研究人员构建了NG-CC-BE（NG-CC-BE3和NG-CC-ABE8e）。测试结果表明，NG-CC-BE在含有NG PAM的位点保持了高效编辑，进一步拓宽了CC-BE系统的应用范围。
CC-BE在原代猪胎儿成纤维细胞中的稳健编辑
在PFF细胞中，CC-CBE的编辑效率相较于未拆分CBE系统有显著提升（如在IGF1位点提升12.4倍），且编辑窗口更宽。CC-ABE也展现了与未拆分ABE相当的编辑效率，而直接拆分的ABE系统效率则低得多。
CC-BE的脱靶效应评估
通过针对特定sgRNA的预测脱靶位点分析、正交R-loop实验评估sgRNA非依赖性脱靶以及全基因组测序（WGS）分析，研究人员对CC-BE的脱靶效应进行了全面评估。结果表明，CC-BE产生的单核苷酸变异（SNV）和小插入/缺失（indel）与未拆分BE以及无sgRNA的对照组相比，没有显著增加，全基因组范围内的SNV分布也无明显区域偏好性，证明CC-BE具有较高的编辑保真度。
CC-ABE介导Fah点突变校正
在Fah突变小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）模型中，利用CC-ABE靶向Fah基因外显子8末端的致病性G-to-A点突变，成功实现了A-to-G校正，恢复了正确的阅读框，证明了其治疗遗传性酪氨酸血症I型（HTI）的潜力。
通过双AAV实现体内高效靶向编辑Pcsk9基因
研究人员使用双AAV8载体递送CC-ABE（sABE-P3P4）至小鼠体内，靶向编辑肝脏中的Pcsk9基因。结果显示，通过腹腔或静脉注射，均能实现高效的A-to-G编辑（在高剂量下可达~70%），并成功降低了血清中的PCSK9水平、总胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平，且未引起急性肝功能障碍，证实了CC-BE在体内降脂治疗中的有效性。
通过双AAV9递送NG-CC-ABE在AEx51小鼠中恢复抗肌萎缩蛋白表达
为治疗杜氏肌营养不良症（DMD），研究人员使用双AAV9载体递送靶向Dmd基因外显子50剪接供体位点的NG-CC-ABE至△Ex51 DMD模型小鼠。通过腹腔或局部肌肉注射，在多种肌肉组织（如心肌、腓肠肌、胫骨前肌等）中均检测到有效的A-to-G编辑，诱导了外显子50跳跃，从而恢复了抗肌萎缩蛋白转录本的阅读框。免疫染色证实了抗肌萎缩蛋白表达的恢复，血清中的肌酸激酶（CK）和α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）等肌肉损伤标志物水平也接近野生型小鼠，表明治疗有效缓解了疾病表型。
综上所述，这项研究成功开发了一种基于卷曲螺旋异源二聚体的通用型拆分碱基编辑平台（CC-BE）。该平台巧妙地解决了大尺寸碱基编辑器难以用单AAV递送的难题，不仅保持了与未拆分编辑器相当甚至更高的编辑效率，还展现出更宽的编辑窗口和良好的靶向特异性。研究人员在多种细胞类型、Cas9变体（SpCas9, SpCas9-NG）以及不同的碱基编辑器（CBE, ABE, TadCBE, ABE9, AYBE）上验证了该策略的有效性，并通过对Pcsk9和Dmd基因的成功体内编辑，证明了其在治疗代谢性疾病和单基因遗传病方面的巨大应用潜力。与已有的拆分技术（如内含肽系统）或微型编辑器相比，CC-BE系统在设计上更为简单灵活，无需在功能蛋白上寻找特定的切割位点，避免了可能影响蛋白功能的“足迹”残留，为未来体内基因治疗提供了强有力的新工具。
