《Nature Communications》：A small molecule VDAC ligand inhibits ERAD and induces selective cancer cell death via disruption of calcium homeostasis
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本研究针对癌症治疗中内质网相关降解（ERAD）通路调控的难题，开发了新型高通量筛选平台，发现小分子化合物NCATS-SM0225能特异性靶向电压依赖性阴离子通道（VDAC），通过IP3R-MCU途径扰乱钙稳态，激活PERK-STIM1信号轴导致关键ERAD调节蛋白降解，最终实现选择性杀伤癌细胞而不损伤正常细胞的效果，为靶向ERAD的癌症治疗提供了新策略。
在细胞这个精密运行的"蛋白质工厂"中，内质网（ER）承担着蛋白质折叠、脂质合成和钙离子储存等重要功能。为了维持内质网的蛋白质质量控制系统，细胞演化出了一套称为内质网相关降解（ERAD）的机制，专门负责识别、转运和降解错误折叠的蛋白质。当ERAD功能失调时，错误折叠的蛋白质会大量积累，引发内质网应激，激活未折叠蛋白反应（UPR）。在癌症细胞中，由于快速增殖和代谢异常，经常处于内质网应激状态，但癌细胞能够巧妙地利用UPR通路来促进自身存活、转移和耐药性。因此，开发能够调节ERAD的小分子化合物，成为了一种有前景的癌症治疗新策略。
然而，目前针对UPR通路的治疗策略面临着诸多挑战。传统的UPR抑制剂往往只能靶向单个UPR传感器（如IRE1α、ATF6或PERK），但由于这些通路之间存在功能重叠和补偿机制，治疗效果有限。更重要的是，PERK抑制剂虽然在体外能够增敏癌细胞对内质网应激的敏感性，但在体内应用时会引起糖尿病等严重副作用，因为胰腺β细胞的正常功能依赖于PERK通路。这些局限性促使研究人员寻找新的策略，即通过调节更上游的ERAD过程来广泛影响UPR信号，而不是针对单个UPR组件。
在这一背景下，美国马里兰大学医学院和国立卫生研究院转化科学促进中心（NCATS）的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们建立了一个创新的高通量筛选平台，发现了一个能够有效抑制ERAD的小分子化合物NCATS-SM0225（简称225），并深入揭示了其独特的作用机制和癌症选择性毒性。
研究人员主要运用了几项关键技术方法：首先开发了基于分裂GFP（drGFP）报告系统的高内涵筛选平台，用于大规模筛选ERAD调节剂；合成了光亲和及点击化学探针（225-cc）进行靶点鉴定；通过微尺度热泳动（MST）和细胞热位移分析（CETSA）验证化合物与靶蛋白的直接结合；利用平面脂质双层膜电生理记录研究VDAC1通道功能；建立了多种基因敲除/敲低细胞模型（包括VDAC isoforms敲除和STIM1敲低）；采用钙离子荧光指示剂实时监测细胞内钙动态；并通过异种移植瘤模型评估体内抗肿瘤效果。研究涉及的细胞系包括HeLa、A375等癌细胞以及原代正常人细胞，测序数据已存入PRIDE数据库（PXD071546）。
高内涵筛选发现小分子ERAD调节剂
研究团队首先开发了一种基于分裂GFP（drGFP）的高内涵筛选方法，能够实时监测ERAD过程中蛋白质从内质网向细胞质的转运（即"脱位"过程）。他们将含有错误折叠蛋白NHK（α-1-抗胰蛋白酶的null Hong Kong变体）与分裂GFP系统结合，当蛋白质成功从内质网脱位至细胞质时，GFP会重新组装并发出荧光。通过这一系统，研究人员对96,047种化合物进行了筛选，最终鉴定出NCATS-SM0225作为一个有效的ERAD抑制剂，它能够剂量依赖性地抑制蛋白质脱位，IC50为1.02μM。
225诱导HEK293细胞中HERP1、OS9和FAM8A1的选择性降解
进一步的研究发现，225处理HeLa细胞24小时后，能够显著下调几种关键ERAD复合物蛋白（HERP1、OS9和FAM8A1）的水平，并伴随PERK的磷酸化激活。机制研究表明，这种下调是通过蛋白酶体降解途径实现的，因为蛋白酶体抑制剂硼替佐米能够阻止这些蛋白的降解。转录组分析证实225处理激活了UPR通路，其中PERK信号通路是最显著被激活的途径。抑制PERK激酶活性能够部分挽救225诱导的HeLa细胞死亡，表明PERK介导的促凋亡信号在225的细胞毒性中发挥关键作用。
225选择性靶向VDAC三种亚型
为了揭示225的作用靶点，研究人员合成了一个含有光交联基团的225衍生物（225-cc），通过光亲和标记与点击化学相结合的策略，成功鉴定出电压依赖性阴离子通道（VDAC）的三种亚型（VDAC1、VDAC2和VDAC3）是225的直接作用靶点。VDAC是线粒体外膜上的主要蛋白质，也富集于线粒体相关膜（MAMs）区域。基因敲除实验显示，敲除任一VDAC亚型都会降低225的结合能力，其中VDAC1的贡献最大。令人意外的是，单个VDAC亚型的敲低就足以显著抑制蛋白质脱位过程，这表明VDAC在ERAD调控中扮演着此前未知的重要角色。
225直接与VDAC1相互作用并调节其功能
通过微尺度热泳动（MST）分析，研究人员确定了225与重组人VDAC1的直接结合，平衡解离常数（Kd）为3.13μM。细胞热位移分析（CETSA）进一步证实225能够增强所有三种VDAC亚型的热稳定性。更重要的是，在平面脂质双层膜系统中，研究人员发现225能够以浓度依赖的方式促进VDAC1在较低电压下的关闭，功能活性IC50为400nM，比溶液中的结合亲和力提高了7.5倍，表明225对膜嵌入状态下的VDAC1具有更高的亲和力。
225诱导线粒体、内质网和细胞质钙离子升高
鉴于VDAC在钙离子转运中的关键作用，研究人员接下来探讨了225对细胞内钙稳态的影响。使用针对不同细胞区室的钙离子荧光探针，他们发现225能够剂量和时间依赖性地提高线粒体、细胞质和内质网中的钙离子水平。这种钙离子升高依赖于VDAC，因为在VDAC1敲低/VDAC2、3双敲除的细胞中，225诱导的钙离子升高几乎被完全消除。此外，钙离子螯合剂BAPTA-AM能够完全阻断225诱导的细胞死亡和HERP1/OS9降解，表明钙信号在225的毒性机制中至关重要。
225优先靶向部分癌细胞而保留正常细胞
在不同癌细胞系中的测试显示，225能够在16种测试的癌细胞系中的11种诱导HERP1、OS9和FAM8A1的降解，而对其余5种细胞系和三种原代正常人细胞（成纤维细胞、表皮黑素细胞和肝细胞）则没有影响。这种降解能力与225的细胞毒性高度相关，降解敏感的癌细胞表现出明显的死亡，而降解抗性的细胞和正常细胞则对225不敏感。在A375黑色素瘤异种移植模型中，每日腹腔注射225（20mg/kg）能够显著抑制肿瘤生长，且未观察到明显毒性。
钙离子内流和IP3R活性介导225诱导的钙离子升高和细胞死亡
机制研究表明，225诱导的细胞内钙离子升高依赖于细胞外钙离子内流，并且受到IP3受体（IP3R）的调控。IP3R抑制剂2-APB能够抑制225诱导的钙离子升高和细胞毒性，同时阻断PERK激活和HERP1/OS9降解。免疫共沉淀实验显示，225能够增强VDAC1与IP3R之间的相互作用，这种增强是钙离子依赖性的。抑制线粒体钙单向转运体（MCU）也能减轻225的细胞毒性，表明线粒体钙摄取在225的作用机制中扮演重要角色。
STIM1调节225诱导的钙离子内流，其磷酸化介导ERAD复合物降解
研究人员发现，STIM1（基质相互作用分子1）这一钙库操纵性钙内流（SOCE）的关键调节因子，在225的作用机制中发挥重要作用。STIM1敲低不仅破坏了基础钙稳态，还阻止了225诱导的钙离子进一步升高。出乎意料的是，STIM1敲低减轻了225诱导的细胞毒性，并降低了PERK表达。进一步的研究表明，225能够增强STIM1与PERK之间的相互作用，并诱导PERK介导的STIM1磷酸化。这种磷酸化对于225诱导的HERP1和OS9降解至关重要。
研究结论和讨论部分强调，这项研究不仅开发了一个高效的高通量筛选平台来识别ERAD调节剂，还意外地发现了VDAC在ERAD调控中的新功能。225通过结合VDAC，扰乱钙稳态，触发PERK-STIM1轴介导的ERAD复合物蛋白降解，最终诱导细胞死亡。特别值得注意的是，225表现出显著的癌细胞选择性毒性，这种选择性可能与癌细胞中VDAC1蛋白水平较高、基础钙水平较低等特性相关。
该研究的创新性在于揭示了VDAC-ERAD-钙信号轴在癌细胞中的新型调控机制，为开发针对蛋白质稳态的癌症选择性治疗提供了新思路。225作为一个先导化合物，具有开发成为first-in-class癌症治疗药物的潜力。同时，研究中所采用的多学科方法（化学生物学、细胞生物学、生物物理学和体内模型）为今后研究复杂细胞过程提供了范例。
研究也存在一些局限性，如对VDAC2和VDAC3的作用机制探索不够深入，缺乏225与VDAC复合物的结构信息，以及225癌细胞选择性的分子基础尚未完全阐明。未来的研究将进一步优化225的化合物特性，深入探索其作用机制，并在更多肿瘤模型中评估其治疗潜力。
