《SCIENCE ADVANCES》：A causal coding variant regulating alternative splicing of DOC2A at 16p.11.2 GWAS locus influences susceptibility to schizophrenia
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本研究针对精神分裂症全基因组关联研究（GWAS）发现的大量风险位点功能机制不清的问题，通过整合人脑组织转录组数据，系统分析了风险单核苷酸多态性（SNP）对RNA剪接的调控作用。研究发现位于16p11.2风险位点的同义变异rs3935873通过调控DOC2A基因产生新型剪接异构体DOC2A?Val217-Pro218，该异构体在小鼠海马过表达可诱发精神分裂症相关行为缺陷和兴奋性突触传递异常，结构建模和互作组分析揭示其获得性功能，为精神分裂症遗传风险机制提供了新见解。
精神分裂症作为最常见的精神疾病之一，全球患病率约为1%，其遗传度高达80%。尽管大规模全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数千个常见风险位点，但由于连锁不平衡的复杂性，区分真正的因果变异仍面临挑战。更关键的是，大多数精神分裂症相关变异位于非编码区，提示它们可能通过调控基因表达发挥作用，而表达数量性状基因座（eQTL）分析仅能解释部分遗传度，这表明需要探索其他调控机制，如异常RNA剪接，才能更好连接遗传风险与疾病发病机制。
在这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究中，研究人员开发了整合分析流程，系统研究精神分裂症GWAS风险变异对选择性剪接的影响。通过结合未注释脑转录组剪接点的剪接数量性状基因座（sQTL）分析与计算功能预测，他们识别出具有病理生理学意义的推定因果变异及其相关的未注释异构体。
研究发现，16p11.2风险位点的一个同义SNP rs3935873调控DOC2A基因的选择性剪接，产生一个截短异构体，该异构体在小鼠模型中可诱导精神分裂症相关行为和突触缺陷。结构互作组分析表明，这个剪接异构体与全长双C2结构域蛋白α（DOC2A）相比，具有独特的构象特性和蛋白结合伴侣，揭示了精神分裂症发病机制中突触功能障碍的新分子机制。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：基于人脑组织RNA测序数据的全基因组sQTL分析；SpliceAI等计算工具预测剪接调控功能；体外迷你基因实验验证变异功能；腺相关病毒介导的海马特异性基因过表达；行为学测试评估精神分裂症相关表型；膜片钳记录突触传递；免疫沉淀-质谱联用分析蛋白互作组。所用脑组织样本来自BrainSeq和CommonMind Consortium队列。
基因组范围sQTL分析识别大量与未注释剪接点mRNA水平相关的精神分裂症风险SNP
利用来自精神病学基因组学联盟第三阶段（PGC3）精神分裂症荟萃分析的GWAS汇总统计数据，研究人员识别出20,457个达到基因组范围显著性的SNP。利用死后背外侧前额叶皮层RNA测序数据，他们系统分析了先前未注释的剪接点，发现10,575个“替代外显子边界”剪接点和11,956个“外显子跳跃”剪接点与精神分裂症风险SNP存在显著关联，且在独立数据集中显示出实质性跨数据集可重复性。
精神分裂症风险位点的功能预测突出调控选择性剪接的变异
使用SpliceAI分析14,463个精神分裂症相关SNP的潜在剪接效应，发现33个SNP表现出高置信度SpliceAI得分。其中，位于16p11.2 GWAS位点的同义SNP rs3935873显示出最高的预测delta得分，并被计算预测会破坏DOC2A选择性剪接。
汇聚证据优先考虑16p11.2 GWAS位点调控DOC2A选择性剪接的编码变异rs3935873
研究人员测量了风险SNP与其相应sQTL剪接点之间的基因组距离，识别出10个高置信度SNP-剪接点对。rs3935873是DOC2A外显子6中的一个风险变异，位于与截短异构体DOC2A?Val217-Pro218相关的sQTL剪接点附近。在BrainSeq背外侧前额叶皮层组织中，rs3935873与DOC2A?Val217-Pro218异构体表达显著相关，而与DOC2AFull-Length异构体表达无关。体外迷你基因实验证实了rs3935873对剪接调控的等位基因特异性效应。
因果变异rs3935873与海马体积相关
利用ENIGMA联盟的大规模成像遗传学数据，研究人员发现rs3935873与海马体积存在稳健关联，精神分裂症风险G等位基因与海马体积增加相关。鉴于rs3935873调控DOC2A?Val217-Pro218的选择性剪接，这些结果提示该转录本在海马生物学和精神分裂症发病机制中的潜在作用。
海马过表达DOC2A?Val217-Pro218导致精神分裂症样行为
为研究DOC2A?Val217-Pro218过表达的行为后果，研究人员靶向成年雄性C57BL/6J小鼠的海马背侧，通过腺相关病毒介导的双侧递送实现基因过表达。行为表型分析显示，与对照组相比，DOC2A?Val217-Pro218过表达小鼠表现出焦虑样行为增加、感觉运动门控缺陷（前脉冲抑制受损）和快感缺乏样行为。相比之下，DOC2AFull-Length过表达小鼠未表现出感觉运动门控缺陷，表明异构体特异性效应。
DOC2A?Val217-Pro218调控兴奋性突触传递
DOC2A已被涉及调节自发谷氨酸释放，但DOC2A?Val217-Pro218在此过程中的作用尚不明确。研究人员发现，DOC2A?Val217-Pro218过表达显著增加微型兴奋性突触后电流的频率和振幅，而DOC2AFull-Length过表达也产生类似效应。两种异构体过表达均未改变微型抑制性突触后电流的频率或振幅。蛋白水平分析显示，突触素表达在过表达DOC2A异构体的神经元中显著升高。
选择性剪接异构体DOC2A?Val217-Pro218具有与DOC2AFull-Length不同的突触功能
整合行为分析揭示了DOC2A异构体之间的功能差异。结构建模表明，DOC2A?Val217-Pro218缺失两个氨基酸，维持整体蛋白结构的同时缩短了表面环。多个亚细胞定位研究显示，两种DOC2A异构体在突触前和突触后区室中分布相似，表明其功能区别可能源于差异分子相互作用而非不同定位。
通过无偏免疫沉淀-质谱联用分析，研究人员识别出DOC2A?Val217-Pro218的98个相互作用蛋白和DOC2AFull-Length的114个相互作用蛋白。基因本体分析发现，DOC2A?Val217-Pro218相互作用组显著富集于钙调蛋白结合、化学突触传递调节和突触后细胞骨架，而DOC2AFull-Length优先与髓鞘、运输囊泡和焦磷酸酶活性相关。分子复合物检测算法进一步突出了这些差异，DOC2A?Val217-Pro218独特相互作用蛋白与肌球蛋白II复合体、超分子纤维组织和锚蛋白结合相关，而DOC2AFull-Length独特伴侣富集于焦磷酸酶活性、髓鞘和ATP代谢过程。
研究结论和讨论部分强调，选择性剪接是连接精神分裂症遗传风险与疾病发病机制的关键分子机制。rs3935873被识别为调控16p11.2精神分裂症相关位点DOC2A选择性剪接的功能变异，该变异通过其风险G等位基因创建隐秘剪接供体位点，展示了单个GWAS位点内变异的多效性功能后果。
值得注意的是，观察到的sQTL效应比该位点的精神分裂症GWAS信号具有更大的统计学显著性，尽管GWAS样本量大约大1000倍。这种显著差异强调遗传变异可能对分子表型施加比疾病诊断本身更强的影响，与精神精神病遗传学中的内表型概念一致。
海马特异性过表达DOC2A?Val217-Pro218足以诱导精神分裂症相关神经功能障碍，而前额叶皮层过表达或海马过表达全长异构体均未产生此效应，表明遗传风险的表型表现深受相关脑区独特神经生物学背景的影响。
虽然DOC2A传统上被认为在调节突触前谷氨酸释放中发挥作用，但研究显示两种DOC2A异构体过表达均显著调节微型兴奋性突触后电流的频率和振幅。然而，通过无偏免疫沉淀-质谱联用分析，发现DOC2A?Val217-Pro218获得独特功能，表明rs3935873介导的选择性剪接可能将DOC2A功能从囊泡启动转变为细胞骨架组织，潜在影响突触结构和可塑性。
这项研究通过全面表征精神分裂症相关遗传变异产生的功能独特DOC2A异构体，建立了GWAS风险位点与突触功能障碍之间的关键机制联系，不仅增进了对精神分裂症遗传架构的理解，也为研究疾病相关剪接异构体如何促进神经精神疾病病理生理学提供了框架。
