《SCIENCE ADVANCES》：Cell surface engineering with a pseudofibrotic ECM reprograms the antifibrotic activity of mesenchymal stromal cells
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本文针对纤维化疾病治疗中移植间充质基质细胞（MSC）存活率低、功能活性不足的难题，报道了一种通过肽修饰透明质酸在MSC表面原位自组装构建仿纤维化细胞外基质（pFM）的新策略。该基质通过激活Piezo1/PI3K-Akt信号通路上调基质金属蛋白酶13（Mmp13）表达，在大鼠心肌梗死模型中显著增强MSC的存活能力和抗纤维化活性，为优化细胞疗法提供了新思路。
当器官组织受损后过度修复，会形成像疤痕一样的纤维化组织，这些异常的细胞外基质（ECM）大量沉积，导致组织变硬、结构破坏，最终引发器官功能衰竭。据统计，全球每年因心血管疾病死亡人数高达1790万，其中心肌纤维化是导致心力衰竭和心律失常的重要危险因素。目前，临床上缺乏有效的抗纤维化治疗方法。
间充质基质细胞（MSC）疗法被视为一种有前景的替代方案，这类细胞能够通过旁分泌信号调节炎症和重塑ECM。然而，经过体外扩增的MSC移植后存活率极低，功能活性有限，导致临床疗效不一致。如何提高移植细胞的存活率并激活其内在的抗纤维化潜能，成为再生医学领域的一个关键挑战。
受到机体自身修复机制的启发——纤维化环境中驻留细胞（如成纤维细胞）会上调基质金属蛋白酶（MMPs）来降解病理性的ECM，研究人员开展了一项创新性研究：能否在MSC表面人工构建一个模拟纤维化ECM的仿生基质，从而“欺骗”细胞，激活其抗纤维化程序？这项发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究给出了肯定的答案。
研究人员开发了一项关键技术：细胞表面工程。他们选择天然多糖透明质酸（HA）作为骨架，通过化学修饰将其与一种酶响应性自组装肽（NapFFKYp）结合，合成出HA-NapFFKYp复合物。在碱性磷酸酶（ALP）作用下，该复合物发生去磷酸化，通过疏水相互作用自组装成纳米纤维，形成类似纤维化ECM的致密无序网络结构。
主要关键技术方法
研究通过合成与表征自组装肽修饰的透明质酸（HA-NapFFKYp），利用酶催化原位自组装技术在单个MSC表面构建仿纤维化基质（pFM）。通过转录组测序（RNA-seq）、实时定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）等技术分析基因和蛋白表达，利用Piezo1特异性激动剂（Yoda1）和抑制剂（GsMTx4）以及PI3K抑制剂（LY294002）探讨信号通路机制。在大鼠心肌梗死（MI）模型中，通过生物发光成像、18F-FAPI PET/CT成像、心脏超声、组织染色（Masson、Sirius Red、H&E）和原子力显微镜等技术评估细胞存活、抗纤维化效果和心功能恢复情况。实验使用大鼠骨髓来源的MSC。
研究结果
仿纤维化基质的构建与表征
研究人员成功合成了HA-NapFFKYp，并证实其在ALP存在下可自组装成具有β-片层结构的纳米纤维，溶液从液态转变为凝胶态，储能模量（G′）显著增加。扫描电镜（SEM）显示凝胶基质呈现多孔网络状结构。通过将HA-NapFFKYp与MSC共孵育，利用HA与MSC表面CD44受体的结合实现材料锚定，再加入ALP引发原位自组装，成功在单个MSC表面形成了仿纤维化基质（pFM）。透射电镜（TEM）、共聚焦显微镜（纳米纤维被刚果红特异性染色）和流式细胞术（单细胞修饰效率达99.5%）证实了pFM的成功构建。研究人员优化了HA-NapFFKYp浓度（0.75%），使pFM在基质厚度（约830 nm）、机械强度（约2.1 kPa）和孔径（约165 nm）之间取得最佳平衡，既能保护细胞，又不阻碍外泌体（30-150 nm）等治疗成分的释放，且细胞活性高。
pFM对MSC的保护作用
研究发现，pFM能有效保护MSC免受病理微环境中缺氧（Na2S2O4诱导）、氧化应激（H2O2诱导）和炎症因子（TNF-α诱导）的损伤。在6 mM Na2S2O4、1.2 mM H2O2和100 ng/ml TNF-α条件下，pFM-MSC的存活率分别为21.3%、22.3%和72.6%，显著高于未修饰MSC（11.2%、9.6%和45.9%）。pFM还能减轻离心剪切力对细胞的损伤。转录组分析表明，pFM能物理阻隔TNF-α与细胞表面受体结合，抑制TNF信号介导的凋亡，上调抗凋亡基因表达，富集于“负调控凋亡过程”等GO条目，从而在炎症微环境中促进MSC存活。
pFM通过Piezo1/PI3K-Akt通路上调Mmp13
RNA-seq结果显示，pFM-MSC中与ECM降解相关的基因（如Mmp3、Mmp10、Mmp13、Mmp17）显著上调，而胶原合成相关基因下调。其中，Mmp13上调最为显著，经qPCR、ELISA和Western blot验证。对照实验表明，Mmp13的上调依赖于纳米纤维结构，而非单纯的HA-CD44结合或共价交联的非纤维凝胶。机制研究表明，pFM激活了MSC的机械敏感离子通道Piezo1，引起Ca2+内流。使用Piezo1激动剂Yoda1能模拟pFM效应，提高细胞内Ca2+水平和Mmp13表达；而抑制剂GsMTx4则能逆转pFM的效应。进一步研究发现，Piezo1激活下游的PI3K-Akt信号通路，促进AKT磷酸化（p-AKT），PI3K抑制剂LY294002可抑制Mmp13的上调。因此，pFM通过Piezo1/PI3K-Akt信号轴增强MSC的Mmp13产生。功能实验表明，pFM-MSC能通过旁分泌方式降解胶原基质，而敲低Mmp13会削弱此能力。
pFM-MSC在体内展示优异的抗纤维化效果
在大鼠心肌梗死模型中，生物发光成像显示pFM-MSC组心脏区域的生物发光信号强度在移植后7天内始终显著高于未修饰MSC组，表明pFM大幅提高了MSC在心肌中的存活率。pFM本身在体内逐渐降解，不会长期滞留。通过18F标记的成纤维细胞激活蛋白抑制剂（18F-FAPI）PET/CT成像实时监测心脏纤维化，发现pFM-MSC组在损伤后第7、14、28天的心肌18F-FAPI摄取下降最快，表明其抗纤维化效果最佳。组织学分析（Masson三色染色、天狼星红染色）显示，pFM-MSC治疗组纤维化面积显著减少，心肌组织保存更完整。羟基脯氨酸含量测定表明pFM-MSC组胶原沉积显著降低。原子力显微镜检测显示pFM-MSC治疗有效恢复了心肌组织的微弹性（硬度），使其接近生理水平。这些效应主要归因于pFM-MSC分泌的Mmp13等MMPs降解了过量的ECM，促进了组织修复。
pFM-MSC有效恢复心脏功能
心脏超声评估显示，移植后28天，pFM-MSC治疗能最有效地改善心功能：左心室射血分数（LVEF）从模型组的32%提升至68%，左心室短轴缩短率（LVFS）从16%提升至40%，均显著优于未修饰MSC组（LVEF 53%，LVFS 28%）。pFM-MSC还显著减轻了左心室舒张末期容积（LVEDV）扩大和左心室质量增加，表明其有效抑制了病理性心室重构。组织学检查发现pFM-MSC组炎症细胞浸润减轻，CD31+和α-SMA+血管密度显著增加，提示其具有更强的抗炎和促血管生成作用。重要的是，敲低Mmp13会显著削弱pFM-MSC的心脏修复功效。安全性评估显示pFM-MSC具有良好的生物相容性，未引起系统性毒性。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种基于分子自组装的单细胞表面工程技术，在MSC表面构建了仿生纤维化纳米纤维基质。该策略不仅显著增强了MSC在恶劣病理环境中的存活能力，更重要的是通过模拟纤维化ECM的物理结构，激活了Piezo1/PI3K-Akt信号轴，特异性上调了关键胶原酶Mmp13的表达，从而重编程了MSC的功能，使其获得强大的抗纤维化能力。
与传统的微流体单细胞封装技术相比，这种自组装方法简单高效（无需特殊设备）、封装效率高（99.5%）、细胞活性好、易于规模化制备，具有显著的转化应用优势。研究揭示了纳米纤维基质通过Piezo1机械敏感通道（而非经典的整合素信号）调控细胞功能的新机制，深化了对细胞微环境物理信号转导的理解。
该研究为优化MSC疗法提供了全新的思路和扎实的科学基础，这种“赋能”细胞而非简单“保护”细胞的策略，为治疗心肌纤维化等顽固性纤维化疾病开辟了新的途径，对再生医学领域具有重要的推动意义。
