《SCIENCE ADVANCES》：Genome-wide screenings identify BAP1 as a synthetic-lethality target with CDK4/6 inhibitors
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本研究针对CDK4/6抑制剂(CDK4/6i)在肝胆癌治疗中易产生适应性耐药的临床难题，通过整合基因组学、表观遗传学和蛋白质组学分析，揭示了BAP1通过去泛素化H2AK119ub修饰激活TCF4/WNT信号通路，诱导肿瘤细胞干性及耐药的关键作用。研究发现，联合使用BAP1抑制剂可显著增强abemaciclib疗效，为克服CDK4/6i耐药提供了新的表观遗传学联合治疗策略。
在精准医疗时代，靶向细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）的抑制剂，如abemaciclib，已在雌激素受体阳性乳腺癌等领域取得显著成效。然而，在原发性肝癌（包括肝细胞癌HCC和肝内胆管癌ICC）中，尽管大部分患者存在细胞周期通路异常，CDK4/6抑制剂的疗效却常因耐药性的出现而大打折扣。这种耐药性，尤其是非遗传因素驱动的“适应性耐药”，成为了临床治疗的一大瓶颈。以往的研究多聚焦于RB1突变、PI3K/Akt/mTOR通路再激活等遗传机制，但对表观遗传层面如何调控耐药仍知之甚少。这促使科学家们深入探索，肿瘤细胞是如何在药物压力下“改头换面”，从而逃逸治疗的。
为了解开这个谜团，一项发表在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）上的研究应运而生。研究人员采用了一种整合性的研究策略，将全基因组CRISPR-Cas9筛选与转录组学（RNA-seq）、表观基因组学（ATAC-seq, CUT&Tag）和蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学分析相结合，系统性地描绘了肝胆癌细胞在CDK4/6抑制剂压力下的动态适应过程。
研究者首先通过分析癌症基因组图谱（TCGA）数据，确认了CDK4/6是肝胆癌中颇具潜力的治疗靶点。随后，他们在多种肝胆癌细胞系、患者来源类器官（PDO）以及小鼠异种移植模型（CDX）中验证了abemaciclib的抗肿瘤活性。然而，与许多靶向治疗类似，持续给药后肿瘤细胞逐渐产生了适应性耐药。为了找出导致耐药的关键基因，研究团队在CDKN2A缺陷（对CDK4/6i敏感）和CDKN2A过表达（相对耐药）的肝癌细胞中分别进行了全基因组CRISPR敲除筛选，旨在寻找与CDK4/6抑制剂存在“合成致死”效应的基因。
这项研究的关键技术方法包括：利用全基因组CRISPR-Cas9筛选技术寻找CDK4/6抑制剂的合成致死靶点；通过患者来源类器官（PDO, n=30）和小鼠异种移植模型进行临床前药效验证；整合RNA测序（RNA-seq）、染色质可及性测序（ATAC-seq）和CUT&Tag技术（用于BAP1、H2AK119ub等）进行多组学分析，揭示耐药机制；采用Chem-map技术绘制CDK4/6抑制剂在基因组上的结合图谱；以及使用免疫印迹、免疫组化、流式细胞术等常规分子生物学方法进行功能验证。临床样本分析包括对110例HCC患者组织芯片的回顾性分析和66例接受CDK4/6抑制剂治疗的乳腺癌患者样本的评估。
CDK4/6抑制作为PLC的候选疗法
研究人员通过分析TCGA数据库发现，肝胆癌中存在高频的细胞周期相关基因改变，提示CDK4/6是潜在的治疗靶点。在体外细胞系、患者来源类器官和小鼠体内模型中，abemaciclib均显示出显著的抗肿瘤效果，证实了CDK4/6抑制剂在肝胆癌中的治疗潜力。
高通量筛选鉴定HCC细胞中细胞周期抑制剂的增敏剂
为了寻找能调节CDK4/6抑制剂敏感性的基因，研究团队进行了全基因组CRISPR筛选。结果发现，在CDKN2A缺陷的细胞中，敲除BAP1、CDK2、PLK1等基因能显著增强abemaciclib的敏感性。其中，BAP1作为一个重要的表观遗传调控因子，在两次筛选中均位列前茅，提示其是关键的合成致死靶点。随后的siRNA敲低和小分子抑制剂联合实验进一步证实了BAP1抑制与CDK4/6抑制剂之间存在强烈的协同效应。
BAP1耗竭限制肿瘤生长并诱导CDK4/6i敏感性
功能实验表明，在多种肝胆癌细胞系中敲除或敲低BAP1，能够降低Rb蛋白的磷酸化水平，抑制细胞增殖和集落形成，并显著增强abemaciclib的敏感性，使IC50值降低。这种增敏效应伴随着G1期细胞周期的阻滞。更重要的是，在荷瘤小鼠模型中，BAP1敲除联合abemaciclib治疗能导致肿瘤显著缩小，其效果远优于单药治疗。药理学上使用BAP1抑制剂（BAP1-IN-1）也得到了类似的结果。
BAP1通过TCF4/WNT和EMT信号诱导细胞可塑性
为了探究BAP1增强CDK4/6抑制剂敏感性的机制，研究人员对BAP1敲除细胞进行了多组学分析。RNA-seq和ATAC-seq结果显示，BAP1缺失导致了深刻的转录组和表观基因组重编程，特别是与细胞干性和可塑性相关的通路被显著抑制，包括WNT/β-catenin信号和上皮-间质转化（EMT）信号。肝脏癌干细胞特征基因（如CD133, OCT4, LGR5）的表达也明显下调。CUT&Tag技术进一步揭示BAP1直接结合在TCF4等基因的启动子区域。BAP1的缺失导致其靶基因（包括TCF4）的染色质可及性降低和表达下调，而过表达BAP1则会上调TCF4的表达。
Chem-map揭示CDK4/6i-DNA相互作用的景观
研究团队采用创新的Chem-map技术，绘制了CDK4/6抑制剂palbociclib（PAL）在基因组上的结合位点。发现PAL的结合位点与CDK4蛋白的基因组结合位点有大量重叠，并且这些共同区域不仅富集在细胞周期相关基因上，也富集在染色质修饰和WNT信号通路相关基因上。更重要的是，BAP1的基因组结合位点也与PAL-btn/CKD4定义的位点共定位，提示BAP1与CDK4/6抑制剂在调控WNT转录程序上存在功能上的相互影响。
BAP1介导的H2AK119ub去泛素化是CDK4/6i耐药所必需的
BAP1是PR-DUB复合物的催化亚基，其主要功能是去除组蛋白H2A第119位赖氨酸的单泛素化修饰（H2AK119ub）。实验证实，BAP1的缺失会导致全基因组范围内H2AK119ub水平的升高，而其野生型的回补能逆转这一现象，但催化失活突变体（C91A）则不能。在TCF4启动子区域，BAP1-WT的表达能特异性降低H2AK119ub的水平，从而解除对TCF4转录的抑制。功能上，过表达BAP1-WT（而非C91A突变体）会诱导对abemaciclib的耐药。这些结果证明BAP1的去泛素化酶活性是其调控TCF4表达和介导耐药的核心。
恢复TCF4启动子处的H2AK119ub可重建对CDK4/6i抑制的耐药性
挽救实验表明，在BAP1敲除的细胞中重新过表达TCF4，能够恢复肿瘤细胞对abemaciclib的耐药性。相反，使用TCF4/WNT通路抑制剂（adavivint）与abemaciclib联用，则表现出强烈的协同抗肿瘤效果。这直接证明了TCF4是BAP1下游的关键效应分子，BAP1主要通过调控TCF4来影响CDK4/6抑制剂的敏感性。
CDK4/6抑制剂适应性耐药的多组学分析
通过长期暴露于abemaciclib构建的耐药细胞系（SNU739R），研究人员进行了深入的多组学分析。结果显示，耐药细胞表现出显著的干性特征和细胞可塑性相关通路的激活，如WNT、EMT、mTORC2和MAPK信号。同时，染色质可及性在干细胞相关基因（如KRT7, EPCAM）位点显著增加。与亲本细胞相比，耐药细胞中BAP1的基因组占据和蛋白表达水平均升高，并且其调控的基因签名与耐药表型高度一致。然而，在耐药细胞中敲除BAP1，能够有效逆转耐药基因签名，恢复对abemaciclib的敏感性。
BAP1表达预测肝胆癌中CDK4/6抑制剂的临床获益
最后，研究在临床前和临床层面验证了BAP1的预测价值。在患者来源类器官中，BAP1抑制剂与abemaciclib联用显示出强大的协同效应。对肝胆癌临床样本的分析发现，BAP1低表达与患者更长的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）相关。一项临床病例显示，一位BAP1低表达的HCC患者在接受palbociclib治疗后，肿瘤显著缩小。此外，在乳腺癌（CDK4/6抑制剂的标准治疗领域）中的回顾性分析也表明，BAP1低表达与更好的CDK4/6抑制剂治疗反应相关，提示这一机制的普适性。
综上所述，本研究揭示了肿瘤细胞应对CDK4/6抑制剂的一种核心非遗传耐药机制：BAP1通过其去泛素化酶活性，去除TCF4启动子区域的H2AK119ub修饰，进而激活TCF4/WNT信号通路，诱导肿瘤细胞获得干细胞样特性和可塑性，最终导致治疗耐药。这一发现不仅深化了对表观遗传调控在适应性耐药中作用的理解，更重要的是，提出了靶向BAP1来克服CDK4/6抑制剂耐药的全新联合治疗策略。研究结果表明，BAP1的表达水平可能作为一个有价值的生物标志物，用于筛选对CDK4/6抑制剂治疗更敏感的患者群体。这项发表于《科学·进展》的工作为改善肝胆癌乃至其他癌症的CDK4/6抑制剂疗效提供了重要的理论依据和转化方向。
