《Analytica Chimica Acta》：A high-throughput detection platform for dried blood spots constructed with DESI-MS/MS
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干血斑（DBS）代谢组学分析中，DESI-MS/MS与UPLC-MS/MS方法优化及比较研究。通过系统优化溶剂比例、提取/喷射流速、角度及电压等参数，DESI-MS/MS展现出与UPLC-MS/MS相当的代谢物覆盖广度、检测稳定性和重复性，并成功应用于含糖大豆奶干预后的代谢指纹分析，验证了两种方法在DBS代谢组学检测中的适用性。
高思琪|赵金辉|关月|刘丽艳
中国哈尔滨市哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生检验系，邮编150086
摘要
背景
干血斑（DBS）技术作为一种血液采集和保存方法，具有采集量少、运输方便以及避免代谢物降解的优点。特别是在新生儿筛查和治疗药物监测方面具有广阔的临床应用前景。解吸电喷雾质谱（DESI-MS）是一种简单、快速且原位的空间代谢组学检测技术，但其相对于传统方法的通量、准确性和覆盖范围仍有待研究。
结果
在UPLC-MS/MS平台上，最佳的提取溶剂、提取溶剂体积和提取方法分别为ACN:H2O（v:v 3:1）、300 μL以及超声提取。基于DESI-MS/MS平台，最佳的喷雾溶剂为MeOH:H2O（v:v 3:1），喷雾速度设定为2 μL/min，喷雾针角度设定为55°，毛细管电压设定为4.5 kv（DESI+）。该方法能够提供一致的数据保证、广泛的代谢物覆盖范围和可接受的重现性。最后，这些方法被应用于检测受试者在饮用含糖豆浆前后体内的代谢谱变化，成功分离出差异代谢物。
意义
构建并优化了两种DBS代谢谱分析方案。与UPLC-MS/MS相比，DESI-MS/MS表现出更好的性能。含糖豆浆的应用表明，所开发的两种方案在检测DBS代谢谱差异变化方面具有实用性。
引言
干血斑（DBS）是一种血液采集和储存技术，通过将全血简单转移到指定的滤纸卡上即可制备[1]。由于其采样压力小、样本量少、易于储存和运输以及生物安全性高的优点，DBS在临床诊断和监测中受到了广泛关注。当前的研究主要集中在新生儿苯丙酮尿症筛查[2]、治疗药物监测[3]、流行病学疾病监测[4]、临床药理学应用以及环境污染物检测[5]等方面。此外，DBS已成为监测遗传性代谢疾病的标准工具。DBS已被用于检测和分析低浓度分析物，例如苯丙酮尿症[6]、脂肪酸氧化功能障碍和有机酸尿症[7]。
由于DBS在样本采集方面的优势，它已被应用于代谢组学研究。代谢组学通过研究内源性小分子代谢物的类型和含量变化，反映了生物体的终端和表型信息，在人类生命科学研究中发挥着重要作用[8]。通过生物标志物的识别，可以促进疾病诊断和预后评估或个性化治疗，从而更好地理解和探索疾病进展或药物调节的潜在分子途径和机制。目前，基于DBS的代谢组学分析已广泛应用于早期心力衰竭的识别[9]、溶酶体贮积病的诊断[10]以及人类胃癌生物标志物的鉴定[11]。Birgit等人研究了先天性纯红细胞再生障碍性贫血的代谢特征，探讨了如何在UPLC-MS/MS分析中实现DBS的通用高效提取[12]。然而，上述研究主要使用LC-MS/MS进行DBS提取后的代谢谱分析，较少关注DBS与直接注入质谱技术的结合。
由解吸电喷雾离子化质谱（DESI-MS）引发的环境分子成像技术作为一种有前景的工具，可以直接检测生物样本中的代谢物，因为它无需繁琐的基质沉积过程[13]。DESI离子源的开放结构使得在常压下可以直接对样本表面进行质谱分析，较好地解决了UPLC-MS/MS分析中样本需要预处理1-3小时的问题。样本的预处理过程容易破坏样本成分、混合其他物质并降低代谢物浓度。最近，DESI-MS/MS已被用于分析DBS中的某些化合物。Wiseman等人[14]利用LC-MS/MS和DESI-MS/MS确定了DBS中的外源物质，结果表明DESI-MS/MS的检测限和定量下限与LC-MS/MS相当。此外，DBS载体材料的选择对实验结果有显著影响。Chen等人[15]评估了几种DBS载体材料后发现，Parafilm基质材料的总信号强度最高。小样本体积是DBS的一个优势，有利于生物样本分析。有研究报道使用DBS（5 μL血液）结合DESI-MS/MS成功建立了快速磷脂组学方法[12]。Markus Siebenhaar等人[16]利用DESI-MS/MS准确分析了DBS样本中的微量水杨酸。所有这些研究表明，DESI-MS/MS可用于DBS样本的定量分析。然而，目前对于使用DESI-MS/MS分析DBS样本的代谢谱研究还较少。因此，有必要通过全面系统的优化实验，开发出高覆盖率和高通量的DBS代谢谱分析方案。
在这项工作中，开发了一种基于DESI-MS/MS的DBS样本代谢谱分析方案。优化了包括喷雾溶剂、喷雾溶剂流量、喷雾角度和毛细管电压在内的参数，并评估了该方案的代谢物覆盖范围、重现性和稳定性。随后将所开发的DESI-MS/MS方案与UPLC-MS/MS进行了比较。最终，在选定最佳方案后，还在摄入豆浆的受试者身上测试并验证了该方案，研究了豆浆摄入引起的复杂代谢变化。
章节片段
化学品和试剂
甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）（色谱级）购自Fisher Scientific（美国加利福尼亚州洛杉矶）。甲酸购自Sigma-Aldrich（英国多塞特）。200 pg/mL的Leucine Enkephalin（Sigma-Aldrich）作为质量测量的参考物质。超纯水来自Millipore Milli-Q Gradient A10系统（美国马萨诸塞州贝德福德）。FTA DMTK卡购自GE Healthcare Life Sciences（美国沃特曼）。血液样本的采集和干血斑的制备
24岁的健康受试者...DESI-MS/MS分析中分析参数的优化
在DESI+和DESI-模式下，优化了包括喷雾溶剂、流量、角度和毛细管电压在内的四个喷雾参数（图1）。通过同时检测三次重复实验中共同特征的峰值数量来评估优化结果。比较了每次实验三次重复中特征强度的变异系数（CV）分布，以判断不同实验的可重复性。结论
总之，本研究优化并比较了两种用于检测DBS高通量代谢谱的方案。基于UPLC-MS，选择AH3:1作为DBS的最佳提取溶剂，超声提取作为最佳提取方法。在DESI-MS/MS中，MH3:1作为最佳喷雾溶剂，最佳喷雾流量为2 μL/min，注射针角度为55°，毛细管电压分别为4.5 kv（DESI+）和4 kv（DESI-。
CRediT作者贡献声明
刘丽艳：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念构建。赵金辉：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学、数据分析、概念构建。关月：验证、监督、方法学。高思琪：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、验证、研究、数据分析、概念构建伦理审批和参与同意
本研究获得了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言进行。所有参与者均签署了书面知情同意书。利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
