基于外泌体膜DNA聚合反应的磁电化学适配体传感技术在骨肉瘤检测中的应用

《Analytica Chimica Acta》：On-Exosome-Membrane DNA Polymerization-Powered Magneto-Electrochemical Aptasensing for Osteosarcoma

骨肉瘤外泌体检测采用膜初始化酶促聚合结合磁珠驱动的电化学aptasensor，实现超灵敏检测（检测限60 particles/μL）和高特异性区分，临床样本验证显示良好适用性。

　　

钟光贤|林黄峰|傅飞环|周静伟|陈崇宇|吴朝阳|林建平|徐雄伟|林建华|陈金元

福建省骨科研究所骨科部门，福建医科大学附属第一医院，福州350005，中国

摘要

背景

基于外泌体的无创液体活检方法的发展对于骨肉瘤（OS）等癌症的早期诊断至关重要。新兴的等温核酸扩增（NAA）集成电化学适配体传感器（E-aptasensor）因其经济性、快速响应、高灵敏度和多重检测能力而具有巨大潜力。然而，这些适配体传感器通常需要将信号触发序列复杂地整合到调控NAA的母适配体中。因此，开发一种无需模板且通用的等温NAA集成E-aptasensor以检测OS来源的外泌体是非常必要的。

结果

在此研究中，我们通过在外泌体膜上利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdTase）介导的DNA聚合，首次提出了一种基于膜启动的酶促聚合（MIEP）的磁驱动E-aptasensor，用于超灵敏地检测OS细胞来源的外泌体。具体而言，LC09适配体修饰的磁性微珠（MMBs）能够高效捕获特定的外泌体。随后，通过TdTase直接在外泌体膜上进行DNA聚合，然后通过免疫反应结合大量辣根过氧化物酶，在磁性玻璃碳电极表面的3,3’，5,5’-四甲基联苯胺/过氧化氢底物上产生强烈的催化电流。这种基于MIEP的E-aptasensor显示出令人满意的检测结果：检测范围广泛（6×10⁷～6×10¹⁰颗粒/mL），检测限低（60颗粒/μL），对其他肿瘤细胞来源的外泌体具有良好的特异性，并且在人血浆中的回收率高达87.9%～98.3%。最后，该方法被应用于不同的临床微量血浆样本并成功区分了它们。

意义

所提出的适配体传感器可作为OS液体活检的强大工具，因其具有高度的通用性、低样本需求和高实用性。此外，本研究中建立的创新设计策略为构建先进的外泌体生物传感器提供了新的、多用途的方法，从而扩展了它们在临床研究和精准医学中的应用。

引言

作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，骨肉瘤（OS）主要发生在青少年中[1]。随着新辅助化疗的可用性，新辅助化疗-手术-辅助化疗的综合治疗模式将OS的5年生存率从20%提高到了约60-70%[2]。然而，对于初次诊断时已有转移的患者，5年生存率仍然很低，仅为20-30%[3]。因此，对OS的早期诊断对于潜在受影响的个体来说具有重要意义。目前，临床实践中常见的骨肉瘤诊断方法主要依赖于对临床特征的全面评估、X射线、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）的影像学发现以及基于生物标志物的术前活检[4]，[5]。然而，由于缺乏特定的临床症状、当前成像技术在描绘癌前阶段形态变化的局限性、侵袭性组织取样的异质性、连续监测的不便以及可靠生物标志物的缺乏，大约80%的骨肉瘤患者在诊断时已经出现微转移[6]。因此，基于生物标志物的无创液体活检方法对于骨肉瘤的早期诊断具有重要意义，这种方法可以覆盖更广泛的人群，并适用于重复筛查。 从生理学角度来看，大多数细胞都能分泌外泌体（EXOs），这些外泌体是直径在30～150纳米范围内的脂质双层膜包裹的细胞外囊泡[7]。外泌体携带来自其来源细胞的多种成分（如核酸和蛋白质），并通过转移关键细胞成分在细胞间通信中发挥重要作用[8]，[9]。越来越多的证据表明，来自癌细胞的外泌体与癌症进展和转移密切相关，并可作为癌症液体活检的潜在生物标志物[10]，[11]，[12]。与通常用于液体活检的循环肿瘤细胞相比，肿瘤细胞来源的外泌体在各种体液中的含量更为丰富。此外，由于其磷脂双层结构，它们能够在体液中稳定存在，有效避免被溶酶体、巨噬细胞和细胞外蛋白酶降解或清除[13]。因此，这些癌细胞来源的外泌体是进行癌症无创早期诊断和评估相关治疗效果的理想且可靠的候选者。 目前，有多种实验室方法用于外泌体的检测和定量，包括流式细胞术、纳米粒子跟踪分析（NTA）、Western blotting和酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]，[15]。然而，这些方法通常需要大量样本、复杂的步骤和昂贵的仪器。迄今为止，生物传感器可以通过多种模式获取读数，包括电化学[16]，[17]、荧光[18]，[19]、比色法[20]，[21]、表面等离子体共振[22]和表面增强拉曼散射[23]。由于这些传感器具有快速响应、多重检测能力、高灵敏度以及经济性和易用性，它们在科学界和技术人员中广受欢迎，并在开发即时检测（POCT）方面具有巨大潜力。因此，对于广大人群而言，基于外泌体的生物传感器的开发将大大提高诊断手段和治疗干预的有效性。 在基于生物传感器的检测中，信号放大策略在提高灵敏度和分析准确性方面起着关键作用。近年来，人们广泛探索了多种放大方法，包括纳米酶辅助放大[24]，[25]，[26]、双链特异性核酸酶（DSN）辅助放大[27]，[28]，[29]、切割内切酶辅助放大[30]，[31]以及等温核酸扩增[32]，[33]，[34]，[35]。其中，等温核酸扩增（NAA）由于具有指数级核酸扩增的固有能力，表现出强大的放大能力。这些NAA方法能够在恒定温度条件下实现高效的核酸扩增，从而消除了传统聚合酶链反应中热循环带来的复杂性和高成本。 利用等温NAA的上述优势，将其与高度特异性的分子识别元件结合，是开发下一代生物传感器的有效策略。在这些元件中，适配体（apts）是一种长度为25-80个碱基的短单链寡核苷酸（DNA或RNA）序列，通常被称为“化学抗体”或“第四代抗体”[36]。与传统抗体相比，这些适配体具有多种物理化学和实际优势，包括良好的稳定性、高结合特异性和亲和力、无毒性、批次间差异小、易于生成和制造成本低[37]。例如，通过细胞SELEX筛选出的一种OS细胞特异性适配体（LC09）对OS细胞具有高结合亲和力和特异性[38]。实际上，多种适配体已被广泛用于构建外泌体生物传感器，其中电化学适配体通过各种等温NAA技术进行集成，包括滚环扩增（RCA）[32]、杂交链反应（HCR）[33]、链置换反应（SDR）[34]和发夹DNA级联杂交反应（HD-CHR）[35]。然而，这些技术需要一个复杂的信号触发序列来启动扩增过程。在适配体结构之前或之后引入信号触发序列可能会复杂化母适配体的构象，并可能改变其与目标的亲和力，这对适配体序列的设计构成了巨大挑战。因此，开发一种无需模板且通用的等温NAA集成电化学适配体以检测癌细胞来源的外泌体是非常必要的。 末端脱氧核苷酸转移酶（TdTase）通常被认为仅在等温条件下将脱氧核苷三磷酸（dNTPs）掺入DNA分子的3’-OH末端[39]，[40]。最近的研究表明，TdTase还可以直接将dNTPs掺入外泌体膜上的酪氨酸残基的糖基和酚羟基中，用于DNA聚合[41]，这为简单精确的外泌体分析提供了新的途径。本研究首次开发了一种超灵敏的电化学适配体传感器（E-aptasensor），通过提出的膜启动的酶促聚合（MIEP）和磁富集及分离方法来检测OS来源的外泌体。结果表明，基于MIEP的磁驱动E-aptasensor在检测和区分OS来源的外泌体与其他干扰样本方面表现出令人满意的性能。由于其无需模板、高度通用性和低样本需求的特点，所提出的E-aptasensor成为OS早期诊断及其治疗效果监测的强大工具。

试剂和材料

胎牛血清（FBS）、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合物由VivaCell Biotechnology（上海，中国）提供。用于外泌体的无血清培养基从Umibio Biotechnology（上海，中国）购买。3,3’，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）底物（Enhanced K-blue底物，含H₂O₂）从Neogen（兰辛，美国）采购。抗地高辛抗体偶联的辣根过氧化物酶（anti-dig-HRP）等试剂也由该公司提供。

基于膜启动的酶促聚合的超灵敏磁驱动电化学适配体传感器检测外泌体的原理

所提出的E-aptasensor用于检测OS来源外泌体的检测原理如图1所示。首先，使用特定于OS来源外泌体的适配体LC09作为捕获探针，在其3’端进行生物素修饰：生物素标记的适配体通过链霉亲和素和生物素之间的非共价相互作用固定在链霉亲和素包被的MMBs表面，形成球形核酸（SNA）捕获-Apt/MMBs。然后，进行SNA捕获...

结论

总之，本研究提出了一种新的等温NAA结合E-aptasensor用于检测外泌体，其中提出了并验证了基于MIEP和TdTase的方法。基于MMBs的分裂型策略将识别过程与检测步骤分离，使这种基于MIEP的E-aptasensor具有高灵敏度、强抗干扰能力和显著区分其他肿瘤来源外泌体的能力。所提出的适配体可作为液体活检的强大工具...

CRediT作者贡献声明

傅飞环：验证、软件、资源。 林黄峰：方法学、研究、数据分析、数据管理。 钟光贤：撰写-初稿、监督、资金获取。 陈金元：撰写-审稿与编辑、项目管理、概念构思。 林建华：监督、资源管理、项目管理。 徐雄伟：可视化、验证、监督。 林建平：资源管理、项目管理。 吴朝阳：验证、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢福建省科技创新联合基金（2024Y9425）；福建医科大学附属第一医院专家互聘启动基金（YJRCHP-2023ZGX）；以及福建医科大学的人才引进启动基金（XRCZX2022029）的支持。