《Bioactive Materials》：NsPEFs-enriched ADSCs-EVs alleviate osteoarthritis via RSPO3-mediated dual pro-chondrogenic and pro-M2 macrophage properties
编辑推荐：
本研究针对骨关节炎（OA）治疗中缺乏能同时促进软骨修复与调节免疫微环境的疾病修饰疗法这一核心难题，探索了纳米秒脉冲电场（NsPEFs）预处理的脂肪干细胞来源细胞外囊泡（NsPEFs-ADSCs-EVs）的治疗潜力。研究发现，NsPEFs-ADSCs-EVs通过其表面富集的整合素α4（ITGA4）激活软骨细胞内的PI3K/Akt通路，进而诱导R-脊椎蛋白3（RSPO3）的分泌。RSPO3发挥双重功能：以自分泌方式增强软骨合成代谢，并以旁分泌方式通过激活巨噬细胞上的LGR4/LRP6/β-联蛋白（β-catenin）轴直接驱动M2型巨噬细胞极化。该研究不仅揭示了RSPO3作为协调组织修复与免疫调节的新型关键介质，而且建立了NsPEFs作为高效生成功能增强型EVs的平台技术，为OA提供了创新的无细胞治疗策略。
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种常见的退行性关节疾病，给全球数亿患者带来巨大痛苦。传统上，OA被视为关节软骨的“磨损”，但现代观点认为，它是一种涉及整个关节的主动病理过程，其核心是持续的、低度炎症与失败的内在修复反应之间的失衡。在OA关节中，滑膜中的促炎巨噬细胞（M1型）驱动软骨细胞功能障碍和细胞外基质降解，而受损的软骨又会释放“警报素”，进一步加剧免疫激活，形成一个恶性的前馈循环。因此，打破这种恶性循环，同步促进软骨合成代谢（修复）和解决炎症（免疫调节），已成为OA治疗的关键范式。然而，目前临床上尚缺乏能够同时实现这两个目标的疾病修饰疗法。
脂肪干细胞来源的细胞外囊泡（Adipose-derived stem cells-derived extracellular vesicles, ADSCs-EVs）作为一种有前景的无细胞纳米治疗平台，凭借其先天的生物相容性和递送生物活性物质的能力而备受关注。但将其推向临床面临两大障碍：一是如何大规模、可重复地生产具有明确增强效力的EVs；二是其确切的作用机制，特别是ADSCs-EVs是否能够通过一个明确的分子轴来协调多细胞修复程序，仍不清楚。
在此背景下，发表于《Bioactive Materials》的这项研究为我们带来了新的见解。研究人员巧妙地利用纳米秒脉冲电场（Nanosecond pulsed electric fields, NsPEFs）对ADSCs进行预处理，旨在不仅提高EVs的产量，更重要的是“改造”ADSCs，使其分泌功能增强的EVs（NsPEFs-ADSCs-EVs）。他们发现，这种工程化的EVs在体外和体内小鼠OA模型中，均展现出优于普通ADSCs-EVs（Ctrl-ADSCs-EVs）的软骨保护和免疫调节能力。机制探索揭示，NsPEFs-ADSCs-EVs通过其表面特异性富集的整合素α4（Integrin subunit alpha 4, ITGA4），激活软骨细胞内的PI3K/Akt信号通路，进而指令软骨细胞增加分泌R-脊椎蛋白3（R-spondin 3, RSPO3）。令人兴奋的是，研究首次发现软骨细胞来源的RSPO3具有新颖的双重功能：一方面，它以自分泌方式作用于软骨细胞自身，增强其合成代谢；另一方面，它以旁分泌方式直接作用于巨噬细胞，通过激活其表面的LGR4/LRP6/β-联蛋白（β-catenin）信号轴，驱动巨噬细胞向具有修复功能的M2表型极化。这项研究阐明了一条从前未被认识的旁分泌轴，其中NsPEFs工程化的EVs利用RSPO3作为关键协调者，同步促进软骨再生和免疫炎症消退。
为开展此项研究，作者团队应用了几个关键的技术方法。研究使用了小鼠膝关节内侧半月板失稳（Destabilization of the medial meniscus, DMM）手术来建立创伤后OA模型。通过纳米秒脉冲电场（NsPEFs）刺激结合差速离心和试剂盒提取的方法，从ADSCs的条件培养基中分离和鉴定细胞外囊泡（EVs），并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和Western blot（WB）对其进行表征。在机制研究层面，综合运用了蛋白质组学分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据挖掘、体外细胞共培养模型、小干扰RNA（siRNA）基因敲低、免疫共沉淀（Co-IP）、分子对接模拟以及体内功能获得性（重组RSPO3蛋白注射）和功能缺失性（AAV-CRISPR/Cas9介导的关节内RSPO3敲低）实验等多种技术手段，系统地验证了从EVs表面成分到下游双效治疗的完整分子通路。
3.1. NsPEFs工程化ADSCs-EVs具有增强的产量、明确的特性及优异的体外生物活性
研究人员首先建立了一种高效的EVs制备方法。他们采用优化的NsPEFs参数刺激ADSCs，然后从其条件培养基中分离EVs。表征结果显示，NsPEFs-ADSCs-EVs和Ctrl-ADSCs-EVs均具备典型的EVs特征，如杯状形态、粒径主要分布在100-160纳米、表达EVs标志蛋白（CD63, CD81, TSG101）且不含负向标志物（Calnexin等）。更重要的是，NsPEFs预处理使EVs的颗粒浓度和蛋白产量均显著提高约10倍，且其Zeta电位绝对值更高，表明胶体稳定性更好。功能上，NsPEFs-ADSCs-EVs被软骨细胞摄取的效率更高，并能更有效地促进软骨细胞增殖，在白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的炎症环境下，更能逆转软骨细胞的分解代谢状态，上调合成代谢基因Col2a1，下调分解代谢基因Mmp13。在巨噬细胞-软骨细胞共培养体系中，NsPEFs-ADSCs-EVs也表现出更强的诱导M2型巨噬细胞极化的能力。这些发现概括了NsPEFs方法的“4H”优势：高产量、高效率、高生物活性和高稳定性。
3.2. NsPEFs富集的ADSCs-EVs在创伤后OA模型中改善疾病进展
在DMM诱导的小鼠OA模型中，每周关节腔内注射NsPEFs-ADSCs-EVs治疗4周。组织学分析（番红O-固绿染色）显示，NsPEFs-ADSCs-EVs治疗能最有效地减轻软骨降解，表现为更低的OARSI评分、更大的软骨厚度和更高的蛋白聚糖含量。同时，该治疗能更有效地重塑滑膜免疫微环境，显著提高滑膜中M2型巨噬细胞（CD163+）的比例，降低M1型巨噬细胞（iNOS+）的比例。活体成像实验表明，NsPEFs-ADSCs-EVs在关节内的滞留时间显著长于Ctrl-ADSCs-EVs，且主要分布在局部关节组织，未在主要脏器检测到系统性分布，显示出良好的靶向性和安全性。
3.3. NsPEFs富集的ADSCs-EVs刺激软骨细胞分泌RSPO3，这是促软骨生成效应的关键介质
为了探寻NsPEFs-ADSCs-EVs发挥双重治疗作用的关键分子，研究人员对经EVs处理的软骨细胞进行了蛋白质组学分析。结果显示，RSPO3是显著上调的蛋白之一。对人类OA患者软骨转录组数据的再分析证实，RSPO3在受损软骨中的表达显著低于完整软骨。体外实验验证，NsPEFs-ADSCs-EVs能显著上调软骨细胞内RSPO3的mRNA和蛋白水平，并促进其分泌。功能实验表明，重组RSPO3蛋白能直接促进软骨细胞增殖和合成代谢，而用特异性抗体中和RSPO3则会抑制NsPEFs-ADSCs-EVs的促软骨生成作用，证明RSPO3是介导该效应的核心分子。
3.4. RSPO3通过LGR4/LRP6/β-catenin信号轴直接促进M2巨噬细胞极化
研究发现，重组RSPO3蛋白能直接作用于骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages, BMDMs），在脂多糖（LPS）/干扰素-γ（IFN-γ）诱导的M1极化背景下，有效促进其向M2表型转化，表现为M2标志物（CD163, CD206, ARG1）上调，M1标志物（iNOS, CD86）下调，同时抗炎细胞因子IL-10分泌增加，促炎细胞因子IL-1β分泌减少。通过间接共培养实验证明，RSPO3是软骨细胞来源的、直接作用于巨噬细胞的必要旁分泌信号。机制上，单细胞RNA测序数据分析和实验验证表明，RSPO3通过结合巨噬细胞表面的LGR4受体，并促进其与LRP6形成复合物，激活经典的Wnt/β-catenin通路，导致β-catenin稳定和核转位。基因敲低实验证实，敲低Lgr4或Lrp6会阻断RSPO3诱导的M2极化及下游β-catenin激活。而使用GSK-3β抑制剂CHIR99021激活β-catenin，则能在Lgr4或Lrp6敲低的巨噬细胞中挽救M2极化。相反，在β-catenin敲低的巨噬细胞中，RSPO3无法诱导M2极化，且CHIR99021的挽救效应也消失。这些结果明确地将RSPO3的促M2效应限定在LGR4/LRP6/β-catenin信号轴内。
3.5. RSPO3对NsPEFs-ADSCs-EVs在OA中的治疗效力既是充分的也是必要的
体内功能实验证实，关节内注射重组RSPO3蛋白足以模拟NsPEFs-ADSCs-EVs的双重治疗效应，能显著减轻DMM小鼠的软骨破坏，并促进滑膜M2巨噬细胞极化。反之，通过AAV-CRISPR/Cas9技术在关节内特异性敲低RSPO3后，NsPEFs-ADSCs-EVs的治疗效果则被显著削弱，其改善软骨组织学和促进M2极化的能力均大大降低。这表明宿主关节内的RSPO3是NsPEFs-ADSCs-EVs发挥治疗作用所必需的。
3.6. NsPEFs-ADSCs-EVs通过ITGA4/PI3K/Akt依赖的机制诱导软骨细胞分泌RSPO3
对NsPEFs-ADSCs-EVs本身的蛋白质组学分析发现，其表面富集了整合素ITGA4。功能阻断实验和基因敲低实验证明，EVs表面的ITGA4对于其被软骨细胞高效摄取以及诱导RSPO3表达至关重要。机制上，NsPEFs-ADSCs-EVs通过ITGA4激活软骨细胞内的PI3K/Akt信号通路，进而驱动RSPO3的表达和分泌。使用PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK-2206均能抑制这一过程。
本研究阐明了一条由NsPEFs工程化ADSCs-EVs启动的、通过RSPO3协调软骨修复与免疫调节的创新机制轴。该研究在方法学和概念上均取得了协同进展。技术上，NsPEFs平台解决了EVs疗法中产量和功能一致性的关键瓶颈，为大规模生产高效力EVs提供了可行路径。概念上，研究颠覆了对软骨细胞在OA中角色的传统认知，揭示其在接受特定EVs信号后，可转化为通过分泌RSPO3主动塑造修复性免疫微环境的信号枢纽。RSPO3被确认为一个具有双重功能的核心效应分子，既能促进软骨合成代谢，又能直接驱动巨噬细胞M2极化，其作用通过明确的LGR4/LRP6/β-catenin信号轴实现。这一发现巧妙地将Wnt发育生物学与关节免疫代谢领域联系起来。此外，研究将EVs表面的ITGA4从一个简单的归巢受体提升为兼具靶向和启动功能性信号转导（PI3K-Akt）的双功能分子，为理性设计下一代可编程EVs疗法提供了新范式。
从转化角度看，本研究提出了三种有前景且可相互补充的策略：重组RSPO3蛋白本身有望成为一种新型局部生物制剂；NsPEFs是规模化生产高效力EVs的可行方案；ITGA4的靶向功能特性使其成为未来工程化EVs的理想靶点，以增强其软骨靶向和修复启动能力。这些策略不仅适用于膝关节OA，也有潜力应用于颞下颌关节OA等其他关节疾病。总之，该研究揭示了RSPO3在关节稳态中的关键作用，并提供了NsPEFs作为工程化平台来规模化生产高效EVs，为开发旨在实现全关节改善的下一代OA疗法铺平了道路。
