《Biosensors and Bioelectronics》：Bulge DNA-driven CRISPR/Cas12a dynamic activation circuit enables highly sensitive and versatile biosensing
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CRISPR/Cas12a动态激活电路CBD实现核酸和非核酸高灵敏度检测，通过bulge DNA结构触发自扩增信号，构建“OR”逻辑门支持多重毒素同步监测。
魏鲁宇|程子琦|徐明瑞|陈恒业|兰伟|龙万军|佘远斌|傅海燕
中国中南民族大学药学院少数民族医学现代化工程技术研究中心，武汉430074
摘要
CRISPR/Cas12a 已成为一种创新的生物传感工具；然而，其切割信号的线性积累限制了检测灵敏度。本文报道了一种由凸起DNA（BD）驱动的CRISPR/Cas12a动态激活电路（称为CBD），该电路是一种高度灵敏且多用途的生物传感平台，可用于检测核酸和非核酸目标。BD结构经过合理设计，在凸起部分降解时能够进行可编程的结构和功能转换，从而触发Cas12a电路的指数级自我放大激活。对于核酸目标，Cas12a的直接识别会引发BD的切割并形成正反馈循环，使得对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检测灵敏度达到14 CFU/mL。对于非核酸目标，将一种通用的单链DNA激活剂连接到适配体互补链上，实现目标响应性的释放并随后启动CBD系统，而无需改变crRNA或BD序列。这种策略使得农药和霉菌毒素的检测浓度可达到皮克克每毫升（picogram-per-milliliter）的水平。此外，还构建了一个“OR”逻辑门，用于同时检测多种霉菌毒素，突显了该平台在多重危险监测方面的能力。总体而言，CBD作为下一代生物传感技术的新范式展现了巨大潜力。
引言
致病危害有多种形式，如病原菌、农药残留物和霉菌毒素，其中许多即使在微量水平下也具有高度毒性（Lei等人，2025年；Wang等人，2024年）。传统的分析技术，如定量聚合酶链反应（qPCR）（Vogels等人，2020年）和高性能液相色谱（HPLC）（Gu等人，2025年），仍然是检测临床病原体、环境污染物和食品毒素的金标准。然而，这些方法通常需要复杂的仪器、繁琐的样品制备过程以及受过培训的人员。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白12a（Cas12a）由于其可编程的识别和切割活性而成为一种强大的分子诊断工具（Hao等人，2023年；Tong等人，2024年）。然而，一个主要限制是信号输出受到目标分子与激活的Cas12a之间一对一化学计量关系的约束（Saha等人，2024年），再加上较慢的催化转化速率（kcat ≈ 1 s-1）（Lim等人，2025年）。因此，信号放大是线性累积的，限制了基于CRISPR/Cas12a的生物传感器的灵敏度，仅能达到皮摩尔级别（Huyke等人，2022年）。为了克服这一限制，人们将各种目标预放大技术整合到CRISPR/Cas12a中，例如HOLMES（Li等人，2018年）和DETECTR（Chen等人，2018年）等平台。尽管这些混合检测方法实现了阿托摩尔级别的灵敏度，但性能提升主要来自于预放大步骤本身，从而削弱了CRISPR/Cas12a作为主要检测机制的作用。因此，迫切需要开发无需预放大的CRISPR/Cas12a生物传感系统，以保持高灵敏度并简化实际应用的工作流程。
为了在不依赖核酸预放大的情况下提高灵敏度，基于CRISPR/Cas12a的生物传感策略大致可以分为三类：（1）协同信号放大。这些策略将CRISPR/Cas12a与下游放大模块结合使用，例如酶催化（例如辣根过氧化物酶）（Samanta等人，2022年；Wei等人，2024年）或核酸后放大技术（例如滚环放大）（Feng等人，2022年；Li等人，2021年）。虽然这些组合可以显著增强信号输出，但它们通常需要额外的生化成分，可能会干扰Cas12a系统的活性或稳定性。（2）催化转化效率提升。这种方法通过蛋白质工程（Cao等人，2025年；Wu等人，2024年）或crRNA的化学修饰（Barber等人，2024年；Li等人，2017年）来提高Cas12a的固有切割效率。尽管这些修饰具有潜力，但它们通常需要大量的人工和时间，且可能影响系统的简单性和可编程性。（3）通过目标富集或信号循环增加激活的Cas12a数量。微反应平台，包括微流控技术（Chen等人，2023年）和微滴系统（Du等人，2023年；Zhao等人，2024年），已被用于浓缩激活的Cas12a复合物并通过空间限制加速反应动力学（Li等人，2023年）。另一种方法是开发核酸电路设计，通过循环驱动的信号循环来增加激活的Cas12a数量（Deng等人，2024年），提供了一种概念上简单但高效的无需预放大的信号放大策略。
迄今为止，仅报道了少数利用核酸电路的基于CRISPR/Cas12a的生物传感系统。例如，Shi等人提出了一种名为CONAN的CRISPR/Cas12a驱动的催化电路，用于高灵敏度检测基因组DNA（Shi等人，2021年）。在该系统中，一种可切换的笼状引导RNA（scgRNA）作为Cas12a的切割底物。在目标识别后，scgRNA从非活性crRNA转变为活性形式，进而激活另一个Cas12a，启动自我传播的信号放大级联反应。尽管CONAN实现了阿托摩尔级别的灵敏度，但由于需要合成含有双荧光团和淬灭剂的scgRNA，因此成本较高。最近，Lim等人引入了一种包含阻塞核酸引发的内部正反馈循环的CRISPR/Cas12a级联电路，实现了快速且无需预放大的检测（Lim等人，2025年）。在该设计中，Cas12a切割阻塞的核酸中间体后释放单链DNA（ssDNA），进而激活新的Cas12a/crRNA复合物进行信号循环。然而，与双链DNA（dsDNA）相比，使用ssDNA作为Cas12a激活剂的效率相对较低（Chen等人，2018年）。这些限制凸显了迫切需要一种成本低廉、快速且高效的可切换分子触发器，以充分发挥基于核酸电路的CRISPR/Cas12a生物传感平台的潜力。
在这项工作中，我们提出了一种由凸起DNA（BD）驱动的CRISPR/Cas12a动态激活电路（称为CBD），用于无需预放大且多用途的生物传感（图1）。BD被合理设计为包含一个原间隔序列（PAM）的dsDNA，并带有凸起结构。在目标识别后，激活的Cas12a同时切割BD中的发夹结构荧光报告基因和凸起区域，凸起部分的降解产生带有5’-磷酸（5’-PO42-）和3’-羟基（3’-OH）末端的DNA。3’-OH末端首先经历3’-5’外切核酸酶处理，然后由Klenow片段进行5’-3’聚合酶延伸，重新生成含有PAM的dsDNA激活剂（图S1）。这一过程允许Cas12a反复激活并实现指数级信号放大，确保高检测灵敏度。对于非核酸检测，由适配体互补的可变区域和Cas12a激活剂标签组成的ssDNA探针与适配体结合，形成功能性核酸（FN），并固定在链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒（MNPs）上。当非核酸目标结合时，适配体发生构象变化，释放ssDNA探针，激活CBD系统生成放大信号。值得注意的是，可切换的BD设计无需任何修饰，可实现指数级信号放大，并且易于扩展到多种分析物，使CBD成为一种简单、高灵敏度且广泛适用的下一代CRISPR/Cas12a检测平台。
部分摘录
使用CBD荧光法检测核酸
对于模态dsDNA的检测，将LbCas12a（200 nM）与通用crRNA在NEBuffer 2.1中于37 °C孵育15分钟来组装Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。对于MRSA的检测，将LbCas12a（200 nM）与MRSA-crRNA（250 nM）和通用crRNA在NEBuffer 2.1中于37 °C孵育15分钟来组装Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。复合物形成后，加入4.3 μL的10× NEBuffer 2.1、3.7 μL的荧光报告基因（5 μM）和5 μL的模态dsDNA
BD作为可切换的激活中间体
最初，直接比较了ssDNA和dsDNA激活剂的Cas12激活效率，这两种激活剂都被设计为与相同的通用crRNA完全互补。如图S3所示，dsDNA激活剂诱导的Cas12a激活效率高于等摩尔的ssDNA激活剂，为dsDNA激活剂介导正反馈循环提供了直接的实验支持。因此，BD被合理设计为一段26个碱基对的凸起dsDNA
结论
总结来说，我们开发了一种由凸起DNA（BD）驱动的CRISPR/Cas12a动态激活电路（称为CBD），实现了真正的指数级信号放大、高灵敏度和多用途检测。CBD系统能够直接检测低至14 CFU/mL的MRSA，并通过MNP辅助的信号转换策略间接检测非核酸目标（乙酰甲胺磷和OTA），灵敏度达到皮克克每毫升（pg/mL）级别。此外，还构建了一个基于双目标“OR”逻辑门的CBD系统
CRediT作者贡献声明
陈恒业：可视化。兰伟：写作——审稿与编辑。魏鲁宇：写作——初稿撰写、可视化、研究、概念化。程子琦：可视化、方法学、研究。徐明瑞：方法学。佘远斌：写作——审稿与编辑、资金获取。傅海燕：写作——审稿与编辑、监督、资金获取。龙万军：写作——审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2023YFF1104002）、中南民族大学的学术创新团队基金（XTZ24029）、湖北省自然科学基金（2025AFB247）以及中央高校的基础研究基金（CZQ25029）的财政支持。
