《Bone》：Clec4a2 deficiency promotes post-fission osteoclast cell death and suppresses acute inflammation-induced bone loss in the mouse
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Clec4a2/Clec4d在骨吸收调节中的双重作用及其治疗潜力研究。通过CRISPR-Cas9技术构建敲除小鼠模型，发现Clec4a2敲除促进骨吸收细胞分化但抑制骨吸收效率，因细胞分裂后死亡；而Clec4d敲除仅轻微影响骨形态。该研究首次证实Clec4a2作为炎症性骨破坏治疗靶点，揭示了骨吸收细胞存活的关键机制。
藤田宏文|太勇马|高桥健二|上田雄人|北川和奈|小野光明|大桥敏隆|大内英男
日本冈山大学医学部、牙科学院及药学部细胞学与组织学系
摘要
为了实现破骨细胞（一种特化的先天免疫细胞）高效地吸收骨骼，不仅要促进破骨细胞的分化和激活，还要维持其存活。C型凝集素（CLEC）受体能够识别病原体配体以及发生改变的自身组织，其中包含激活型和抑制型受体，这种平衡既能清除病原体，又能防止过度的免疫反应。然而，CLEC受体在破骨细胞分化、功能及存活中的作用仍不明确。我们建立了高表达破骨细胞CLEC受体的敲除（KO）小鼠，并分析了破骨细胞的特征和骨骼形态。我们利用小鼠基因表达数据集对破骨细胞谱系特异性CLEC受体进行了全面的计算机模拟筛选，并通过多靶点CRISPR-Cas9系统生成了Clec4a2和Clec4d的单基因及双基因敲除（DKO）小鼠。Clec4a2 KO和DKO小鼠在体外增强了破骨细胞的分化，Clec4a2 KO还促进了破骨细胞的增大。Clec4d KO略微减少了股骨的 trabecular 骨密度，而在生理条件下Clec4a2 KO和DKO小鼠的骨骼形态未受影响。与传统观点（即破骨细胞分化增强会导致骨骼吸收增加）相反，我们的时间序列分析显示Clec4a2 KO小鼠虽然增加了破骨细胞的数量，但由于分裂后破骨细胞及其子细胞的死亡，反而降低了吸收效率。Clec4a2 KO小鼠对脂多糖诱导的炎症性骨丢失具有保护作用，这表明Clec4a2可能成为治疗炎症性骨溶解性疾病的新靶点。本研究提出了一种新的机制：CLEc4a2对破骨细胞存活的调节对于高效吸收骨骼至关重要。
引言
骨骼组织通过成骨细胞（形成骨骼）和破骨细胞（吸收骨骼）之间的动态平衡不断重塑，健康人体内大约10%的成熟骨骼组织每年都会更新[1]，[2]。成骨细胞和骨细胞产生对破骨细胞存活和分化至关重要的调节分子，尤其是巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体激活剂配体（RANKL，属于TNF超家族）[3]。这些细胞因子刺激单核-巨噬细胞谱系细胞，使其分化为成熟的破骨细胞。此外，Fc受体共同γ亚基和DNAX激活蛋白12均含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs），它们介导RANK-RANKL信号通路中的共刺激信号[4]，[5]。急性及慢性炎症状态（如骨折和类风湿性关节炎）会引发炎症性骨丢失[4]。活化后的破骨细胞通过RANKL（由促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6刺激）表达而过度吸收骨骼。因此，免疫系统的多个组分都参与了骨骼代谢和骨骼疾病的发生。
C型凝集素（CLEC）受体是一类重要的碳水化合物结合蛋白，在病原体识别和免疫调节中发挥关键作用[6]，[7]，[8]。这些受体具有一种或多种C型凝集素样结构域，能够识别碳水化合物及其他配体，包括病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）以及自身组织中的改变标记物。CLEC受体主要表达于髓系细胞群体中，如树突状细胞和巨噬细胞。从功能上看，CLEC受体分为激活型和抑制型：激活型CLEC受体利用ITAMs触发促炎反应，而抑制型CLEC受体则通过免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIMs）抑制免疫活性[6]。
过去十年的研究显示，多种CLEC受体参与了骨骼代谢和骨骼疾病[9]。含有ITAM的CLEC受体Clec5a（也称为MDL-1）在自身免疫性关节炎症、登革病毒感染和肠道炎症过程中是破骨细胞生成和骨侵蚀的关键调节因子[10]，[11]，[12]。Clec4d（也称为MCL）和含有ITIM的CLEC受体Clec4a2（也称为DCIR）可促进破骨细胞生成，但不影响成骨细胞分化[13]。另一项研究则指出Clec4a2在胶原诱导的关节炎中调节破骨细胞生成和关节破坏[14]。含有ITIM的CLEC受体Ly49Q可正向调节破骨细胞分化[15]，但不会影响骨骼形态。尽管已有研究表明含有ITAM和ITIM基序的CLEC受体参与骨骼代谢和炎症性骨破坏，但它们在免疫调节机制中的实际功能仍需进一步验证。
基于这些发现，我们重点研究了在破骨细胞谱系中高表达的CLEC受体，旨在通过单基因和多基因敲除方法阐明这些受体在骨骼代谢中的功能关系及其在破骨细胞分化和吸收能力中的作用。在本研究中，我们通过计算机模拟分析了破骨细胞谱系中高表达的CLEC受体，并通过生成敲除小鼠来研究它们的作用。
动物实验
所有动物实验程序均获得了冈山大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：OKU-2021774、OKU-2021775、OKU-2022922、OKU-2022923、OKU-2022977、OKU-2022981、OKU-2022984和OKU-2024441）。实验用小鼠（C57BL/6N，RRID:MGI:2159965）购自日本SLC公司（静冈）。小鼠被饲养在每个笼子最多五只的条件下，处于无特定病原体（SPF）环境中，光照/黑暗周期为12小时，温度为23°C。
利用多靶点CRISPR-Cas9系统生成Clec4a2 KO、Clec4d KO和Clec4a2/4d DKO小鼠
首先，我们利用包含骨髓巨噬细胞、破骨细胞以及89种其他细胞类型和组织的小鼠基因表达数据集，对破骨细胞谱系特异性受体进行了全面的计算机模拟分析。我们鉴定出几种CLEC受体——特别是Clec4a2、Clec4d和Clec5a——这些基因在破骨细胞中具有谱系特异性和高表达模式（补充图S1A）。这些基因在C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（BMMs）及由BMMs衍生的破骨细胞中的表达情况如下：
讨论
为了实现破骨细胞高效吸收骨骼，不仅要促进破骨细胞的分化和激活，还要维持其存活。根据含有ITIM基序的Clec4a2的结构特征，人们原本认为它会抑制破骨细胞的吸收功能。然而，本研究意外地发现，Clec4a2基因的缺失反而促进了破骨细胞及其分裂后子细胞的死亡。
CRediT作者贡献声明
藤田宏文：撰写初稿、验证、监督、软件使用、项目管理、方法设计、实验设计、资金申请。
太勇马：实验研究。
高桥健二：实验研究。
上田雄人：实验研究。
北川和奈：实验研究。
小野光明：实验研究。
大桥敏隆：撰写、审稿与编辑。
大内英男：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金申请。
利益冲突声明
无。
致谢
本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI项目（编号：19K09625、20K21655、22K09305）以及冈山县科学技术振兴厅的资助。同时感谢T. Bando和K. Sato的讨论与合作。
