肝素和低分子肝素是广泛使用的抗凝剂，其复杂的结构使得完全表征变得具有挑战性。色谱分析技术和核磁共振（NMR）是关键的技术手段。通常通过肝素酶消化来实现解聚，然而使用亚硝酸进行脱氨基切割对于保持尿苷酸的C5构型仍然至关重要。我们重新研究了亚硝酸解聚方法，并通过还原胺化引入磺胺酸标记技术来克服检测限制。这使得基于紫外光谱的检测和定量成为可能，能够在1.5天的流程中完成二糖和乙酰化四糖的分析。优化这种标记策略后，能够清晰地识别出亚硝酸切割产生的主要组成单元。对猪黏膜肝素、羊黏膜肝素、牛黏膜肝素和牛肺肝素进行的比较分析显示了不同的特征，尤其是在乙酰化组分中。硫酸化的乙酰化二糖主要以艾杜糖为主，而非硫酸化的乙酰化二糖IVa在四种肝素中都表现出艾杜糖/葡糖醛酸的混合构型。IVa单元几乎不存在于内部链区域，而是在连接区的非还原端以甘氨酸形式被检测到。我们建立了包含甘氨酸影响与否的乙酰化结构的整体平衡，并将其与作为定量参考的酶法组成分析方法进行了比较。亚硝酸解聚仍然是肝素分析的关键方法。改进后的条件提高了灵敏度和色谱分辨率，增强了分析潜力。尽管该协议相对复杂，但结果尤其是对于乙酰化组分而言，提供了宝贵的生物合成见解。
肝素是一种高度硫酸化的异质线性聚合物，因其抗凝特性而被用于治疗深静脉血栓形成。从猪黏膜中提取的肝素也是合成低分子肝素（LMWH）的起始材料。肝素基本上是由二糖重复单元组成的线性链，这些二糖交替包含艾杜糖或葡糖醛酸以及氨基葡萄糖。硫酸化模式是由复杂的生物合成机制决定的，主要包括四个主要酶促步骤：首先，氨基葡萄糖中的N-酰基部分被N-硫酸基取代；其次，尿苷酸在C5-异构酶和硫酸转移酶（2-OST）的共同作用下发生转化，前者将葡糖醛酸构型转变为艾杜糖构型，后者部分硫酸化2-O位点；最后两个步骤中，硫酸转移酶（6-OST和3-OST）分别部分硫酸化氨基葡萄糖的6-O和3-O位点。
肝素的寡糖链由20-30个二糖序列组成。硫酸化模式、尿苷酸构型及其序列顺序是决定肝素生物活性的结构基础。肝素的抗凝活性通过与抗凝血酶（ATIII）的相互作用来实现，后者抑制凝血级联反应中的关键蛋白，主要是因子Xa和因子IIa（凝血酶）。抗凝血酶与肝素的初始结合依赖于肝素中存在的特定3-O硫酸化五糖序列，该序列的精确组成、硫酸化位点和尿苷酸构型对其活性至关重要。
因此，肝素的结构表征是一个巨大的挑战，由于需要确定的参数众多且肝素的高度异质性，无法全面完成。尽管无法实现肝素的完全结构表征，但彻底的分析对于确保其作为药物和LMWH前体的安全性和有效性仍然是必不可少的。2008年期间，中国市场上出现了一批含有过量硫酸化软骨素的肝素批次，这一事件促使人们加大了对肝素分析的力度，以检测欺诈样品。
肝素的分析技术通常与LMWH的分析技术相似。然而，单一方法不足以满足所有需求。需要结合具有不同选择性的多种方法，如凝胶渗透色谱（GPC）、抗凝血酶亲和色谱（ATIII亲和色谱）和强阴离子交换（SAX）色谱，才能获得满意的分析结果。由于肝素比LMWH体积更大，因此需要额外的解聚步骤；对于LMWH，这一步骤是可选的，因为小于十四糖的GPC组分可以直接进行色谱分析。
使用来自Flavobacterium heparinum的裂解酶或单独使用[2]、[3]或联合使用[4]、[5]的肝素酶进行部分或完全的酶解聚是一种非常有效的方法，可以减小肝素的大小，使其适合分析方法。通过β-消除作用切割氨基葡萄糖（1→4）与尿苷酸的连接，会在非还原端产生Δ4-5不饱和尿苷酸，这可以通过紫外光谱轻松检测到。使用肝素酶I+II+III进行完全解聚是一种高效的组成单元分析方法[4]、[5]，可以生成二糖和四糖的混合物。这种方法相对容易实施，是肝素开发和批次比较中常用的关键方法之一。然而，尽管有这些优点，该方法仍不足以完全表征肝素，因为它无法提供关于尿苷酸构型的信息，因为这些信息在β-消除过程中会丢失。
据我们所知，只有一种方法，即亚硝酸脱氨基切割（NDC），可以提供这些信息。这项技术最早由Shively和Conrad在1976年描述[6]，它使用亚硝酸切割N-硫酸化氨基葡萄糖的还原键，在脱氨基后生成新的2,5-脱氢-D-甘露糖（aMan）还原端（RE），而不影响非还原端的尿苷酸部分。
在pH1.5条件下，GlcNSO3H-UA键会被HONO切割；而对于GlcNH2-UA键，则需要将pH调整到4[6]。相比之下，N-酰基氨基葡萄糖不会被切割，反应后仍保持为四糖或更复杂的结构。掌握NDC技术对于任何关于肝素生物合成的研究都是必不可少的[7]、[8]。最重要的是，这项技术对于理解和控制生物工程寡糖的化学酶促过程是必需的。然而，尽管亚硝酸解聚目前被用于合成如Dalteparin和Nadroparin等LMWH[9]，但由于其在制药环境中的实施难度较大，因此很少被使用。此外，在原始方法[10]、[11]中，使用肼解法去除N-酰基以简化分析过程，但这种方法在制药环境中具有挑战性，且现在已不再适用，因为无水肼难以获得，必须使用水合形式的肼。
由于需要确定的参数众多以及肝素的高度异质性，肝素的结构表征是一个巨大的挑战。尽管无法实现肝素的完全结构表征，但彻底的分析对于确保其作为药物和LMWH前体的安全性和有效性仍然是必要的。2008年的肝素质量危机期间，这一挑战尤为突出，当时中国市场上有部分肝素被掺入了过量的硫酸化软骨素。这一事件促使人们加大了对肝素分析的力度，以检测假冒样品。
肝素的分析技术通常与LMWH的分析技术相似。然而，单一方法不足以满足所有需求。需要结合具有不同选择性的多种方法，如凝胶渗透色谱（GPC）、抗凝血酶亲和色谱和强阴离子交换（SAX）色谱，才能获得满意的分析结果。由于肝素比LMWH体积较大，因此需要额外的解聚步骤；对于LMWH，这一步骤也是可选的，因为小于十四糖的GPC组分可以直接进行色谱分析[1]。
使用Flavobacterium heparinum的裂解酶或肝素酶进行部分或完全的酶解聚是一种非常有效的方法，可以减小肝素的大小，使其适合分析方法。通过β-消除作用切割氨基葡萄糖（1→4）与尿苷酸的连接，会在非还原端产生Δ4-5不饱和尿苷酸，这可以通过紫外光谱轻松检测到。使用肝素酶I+II+III进行完全解聚是一种高效的组成单元分析方法[4]、[5]，可以生成二糖和四糖的混合物。这种方法相对简单，是肝素开发和批次比较中常用的关键方法之一。然而，尽管有这些优点，该方法仍不足以完全表征肝素，因为它无法提供关于尿苷酸构型的信息。
据我们所知，只有亚硝酸脱氨基切割（NDC）方法可以提供这些信息。该技术最初由Shively和Conrad在1976年描述[6]，它使用亚硝酸切割N-硫酸化氨基葡萄糖的还原键，在脱氨基后生成新的2,5-脱氢-D-甘露糖（aMan）还原端（RE），而不影响非还原端的尿苷酸部分。
在pH1.5条件下，GlcNSO3H-UA键会被HONO切割；而对于GlcNH2-UA键，则需要将pH调整到4[6]。相比之下，N-酰基氨基葡萄糖不会被切割，反应后仍保持为四糖或更复杂的结构。掌握NDC技术对于任何关于肝素生物合成的研究都是必不可少的[7]、[8]。最重要的是，这项技术对于理解和控制生物工程寡糖的化学酶促过程是必需的。然而，虽然亚硝酸解聚目前被用于合成如Dalteparin和Nadroparin等LMWH[9]，但由于其在制药环境中的实施难度较大，因此很少被使用。此外，在原始方法[10]、[11]中，使用肼解法去除N-酰基以简化分析过程，但这种方法在制药环境中具有挑战性，且现在已不再适用。
解聚后产生的大量组成单元[12]、[13]、需要将分析分为两部分（二糖和乙酰化组分）以及不可避免的副反应（环收缩（RC）（图1）（由脱氨基但不切割引起，生成醛糖）都是需要克服的挑战。此外，解聚后生成的组成单元在紫外光谱下透明，无法用常规检测方法检测到。由于aMan还原端过于活泼，需要通过还原处理进行稳定。因此，常用的解决方案是用NaB[3H]4还原消化混合物[14]，然后通过带有放射性检测器的HPLC进行分离[15]、[16]。放射性检测虽然灵敏度较低，但需要控制反应区域，因此实施起来较为复杂。如果使用NaBH4作为还原剂，则质谱（MS）是LC/MS色谱分离中唯一的可用检测方法[12]、[13]、[17]。然而，尽管MS是一种强大的鉴定方法，但由于响应系数的多样性，它作为一种定量方法效率较低，需要外部标准化。
NDC后对组成单元进行标记是一种避免放射性检测困难的自然方法。Kariya等人[18]描述了一种使用对硝基苯肼标记aMan的方法。然而，这种方法只能在色谱图中识别常见的二糖组成单元，并且没有提及乙酰化部分。在另一项关于壳聚糖中乙酰氨基葡萄糖分布的研究中，Han等人[19]使用苯甲基吡唑烷标记脱氨基后的aMan末端。这两种标记方法似乎都不适用于分辨率足够的色谱分离，无法获得像肝素NDC产物那样复杂的混合物的满意结果。
在这项工作中，我们成功使用了磺胺酸通过吡啶硼烷进行还原胺化来标记NDC产生的组成单元，这种方法之前已应用于肝素酶消化得到的肝素片段[3]、[5]、[20]。磺胺酸的紫外吸收能力不强，但在温和条件下标记效果良好，且没有显著的副反应（图1）。标记后的组成单元既可以在强阴离子交换柱上分离（这种分离方式对这类混合物非常有效），也可以在离子对LC/MS中分离。此外，它们还适用于低压凝胶渗透色谱，这对于处理亚硝酸降解混合物非常重要。
由于近年来Ba(NO2)2的供应有限（可能与其毒性有关），因此无法直接应用传统的肝素NDC方法[7]、[15]。因此，我们修改了原始方案，使用NaNO2作为硝化剂。此外，还应用了磺胺酸还原胺化标记，既标记aMan二糖（图1），也标记N-酰基组分（主要是四糖）。
磺胺酸标记按照之前的描述[3]进行。同样，已经用于肝素酶消化后组成单元分析的两种色谱系统，即带有紫外检测的Ionpac AS11色谱和离子对LC/MS，也被直接用于优化NDC条件。
由于得到的混合物过于复杂，无法直接分析，因此采用了GPC将二糖与高分子量组分分离（图1 GPC1）。为了获得代表性的N-酰基组分，进行了温和的酸水解以切割环收缩，采用了Lindahl等人[21]改进的工艺。随后进行了第二次GPC分析（图1: GPC2），以去除水解环收缩的残留物并获得磺胺酸标记的乙酰化组分。
鉴定出了主要的组成单元，包括二糖和四糖。比较了不同来源的肝素产生的二糖和乙酰化四糖组分。
在这项工作中，特别关注了乙酰化二糖单元中尿苷酸的构型及其硫酸化程度。在N-硫酸化二糖中，C5-异构酶的作用促进了艾杜糖和葡糖醛酸之间的平衡，这种作用受到2-O位点硫酸化选择性的影响；已知在肝素中，80-85%的N-硫酸化二糖也是2-O硫酸化的（补充数据，表17S）。N-酰基二糖的2-O硫酸化程度较低（20-30%）（补充数据，表17S），然而我们发现，在肝素中，即使只进行单次6-O硫酸化，它们也主要是艾杜糖。
