肉桂酸通过PPARγ信号通路在斑马鱼中诱导神经发育缺陷

《Chemico-Biological Interactions》：Cinnamic acid induces neurodevelopmental defects via PPARγ signaling in zebrafish

肉桂酸（CA）在4mg/L和8mg/L浓度下导致斑马鱼幼虫神经发育缺陷，表现为体型缩短、行为异常及高死亡率。网络毒理学和分子对接确定TNF、CASP3、IL6、PPARG为关键靶基因，实验证实CA上调tnf-α、IL-6和CASP3表达，下调PPARG，抑制AChE、ATP酶及抗氧化酶活性，引发氧化应激、炎症和凋亡。叶黄素可缓解上述效应，提示PPAR-γ介导的氧化应激和炎症是CA神经毒性的机制。

　　

彭丽霞|王浩旭|李亚芳|刘晓宇|常凯辉|易文新|王宝坤|曾楠|李志强|吴传红

青岛大学附属医院、青岛大学生物医学科学研究所（上海交通大学Bio-X研究所青岛分所）及青岛大学药学院，中国青岛

摘要

肉桂（Cinnamomum cassia Presl）在中国传统上被用于温身、驱寒和止痛。它是一种常用的中药和香料，在日常保健中广泛应用。肉桂酸（CA）是从肉桂皮中提取的主要活性化合物之一。在本研究中，我们发现4 mg/L和8 mg/L浓度的肉桂酸会导致斑马鱼出现神经发育缺陷，表现为体长缩短、躯干弯曲、行为异常和死亡率增加。通过网络毒理学和斑马鱼实验，我们探讨了肉桂酸引起神经毒性的潜在靶点和生物学机制。共有154个与肉桂酸相关的靶基因与神经毒性相关基因存在重叠。利用Cytoscape软件中的不同算法，最终确定了4个关键靶基因：TNF、CASP3、IL6和PPARG，并通过分子对接进一步验证了这些基因的作用。接下来，我们在斑马鱼中验证了这些靶基因的功能。肉桂酸上调了tnf-α、il-6和casp3基因的表达，同时下调了pparg基因的表达。此外，它还能抑制AChE、ATP酶、CAT和SOD的活性，降低神经元荧光强度，并增加巨噬细胞和中性粒细胞的数量以及ROS和MDA的水平。此外，它还能诱导斑马鱼幼体的细胞凋亡和神经发育相关基因的异常表达。抗氧化剂虾青素能够改善行为障碍和神经发育相关基因的表达；当PPAR-γ表达增强时，行为障碍、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡水平也会得到缓解。所有这些数据表明，肉桂酸对斑马鱼的神经发育毒性可能通过PPAR-γ介导的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡机制发挥作用。

引言

肉桂酸（CA）是一种天然芳香羧酸，从肉桂皮中提取，具有白色晶体、低强度的蜂蜜样甜味、低水溶性和可溶于所有有机溶剂的特性。它还存在于肉桂、罗勒油、悬铃木、水果和蔬菜等多种植物中，广泛应用于医药、香水、聚合物、化妆品、消毒剂和农业领域（Kimani等人，2023年）。研究表明，肉桂酸具有抑制全身炎症、增强内毒素暴露小鼠的免疫功能以及保护肾脏免受顺铂损伤的作用（Ruwizhi和Aderibigbe，2020年）。

毒理学家开始关注低毒性的肉桂酸，主要是因为其分子结构与某些有毒分子（如苯乙烯）相似。先前的研究评估了肉桂酸的毒性，发现它不具有遗传毒性、光毒性和光致过敏性，也不会引起皮肤敏感（Api等人，2022年）。此外，有报道指出肉桂酸类似物对H9C2细胞具有心脏毒性，并导致LDH水平升高（Mandal等人，2022年）。富含肉桂酸等酚类化合物的Petiveria alliacea L.的乙醇提取物可诱导Saccharomyces cerevisiae CD138(ogg1)菌株的突变（Cal等人，2022年）。一项关于蚕豆的研究表明，肉桂酸会降低组织结构的抗性并促进萎蔫现象的发生。然而，关于肉桂酸的毒性研究仍较为有限，尤其是其对神经系统的毒性作用仍缺乏强有力的体内实验证据。

由于斑马鱼胚胎发育迅速且其基因组与人类药物靶点有86%的相似性，因此它们已成为广泛使用的体内毒性测试模型。通过在发育过程中直接暴露于外源性物质，可以对斑马鱼进行发育毒性测试。孵化后，可以通过自动化运动行为分析来评估其对各种刺激的反应，从而评估其神经发育功能（Gaballah等人，2020年）。此外，斑马鱼幼体及其转基因系（如Tg (lyz:?DsRed)、Tg (mpeg1:?EGFP) 和 Tg (elavl3:?EGFP）具有细胞和组织特异性的荧光蛋白表达，便于观察其神经发育过程和神经活动（Wang等人，2022年；Wang等人，2023年）。因此，斑马鱼常被用于研究神经系统发育及其相关疾病机制。

基于斑马鱼的体内成像和神经功能分析平台，本研究表明肉桂酸暴露影响了斑马鱼幼体的早期神经发育和自主行为，并通过网络毒理学、分子对接和体内实验系统地探讨了其毒性机制。

试剂和材料

肉桂酸（纯度>98%）购自成都Chroma-Biotechnology有限公司（中国成都）。虾青素和neopterin购自MedChemExpress Biotech有限公司（中国上海）。YO-PRO-1/PI凋亡试剂盒和DCFH-DA购自Beyotime Biotechnology有限公司（中国上海）。乙酰胆碱酯酶（AChE）活性检测试剂盒购自Solarbio Technology有限公司（中国北京）。Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶、Na⁺-K⁺-ATP酶和过氧化氢酶（CAT）也来自同一公司。

肉桂酸对斑马鱼幼体的神经发育毒性

斑马鱼幼体表现出发育迟缓、卵黄畸形和尾部卷曲（图1A）。24小时大的胚胎在肉桂酸作用下自发的尾部弯曲运动显著减缓（图1B），72小时大的幼体体长缩短（图1C），前者是神经发育状态的关键指标。此外，24小时和48小时大的幼体死亡率均显著升高（图1D）。

讨论

肉桂酸在食品工业、制药行业和化妆品行业有广泛应用。它不仅可以作为香料为食品增添风味和香气，还可以作为防腐剂延长食品保质期，确保食品的安全性和新鲜度，使其成为不可或缺的添加剂。尽管研究表明肉桂酸具有抗癌、抗糖尿病和神经保护等多种药理作用（Ruwizhi和Aderibigbe，2020年），但其体内

结论

总之，我们的研究表明肉桂酸可通过氧化应激、炎症和PPARγ介导的细胞凋亡途径对斑马鱼的神经发育造成毒性（图8）。此外，本研究的结果为减轻肉桂酸的毒性提供了潜在的信号调控机制。然而，本研究存在一些局限性，尤其是如何将斑马鱼与人类的剂量进行转换仍是一个挑战。我们的研究仅关注了肉桂酸对水生生物的毒性作用。

CRediT作者贡献声明

李亚芳：数据可视化、数据整理。彭丽霞：初稿撰写、数据可视化、验证、正式分析、数据整理。王浩旭：数据可视化、数据整理。吴传红：撰写、审稿与编辑、方法学设计。曾楠：资源获取。李志强：撰写、审稿与编辑、研究监督、概念框架构建。易文新：数据可视化、数据整理。王宝坤：数据整理。刘晓宇：数据可视化、数据整理。常凯辉：方法学设计

未引用参考文献

Muhammad等人，2021年。

利益冲突声明

作者声明与本手稿不存在任何利益冲突。

致谢

我们非常感谢所有参与者的贡献。本研究得到了国家自然科学基金（编号：82474339、82271540）、山东省自然科学基金（编号：ZR2025MS1189）以及青岛医科大学“医学+”跨学科集群联合探索项目（RZ2400001468）的支持。